单核苷酸多态性微阵列技术在胎儿颈部淋巴水囊瘤产前诊断中的应用研究

雷亚琴，罗静思，欧阳鲁平，杨祚建，黄朋，易赏，费冬梅，何升*

胎儿颈部淋巴水囊瘤(cervical cystic hygroma，CCH)是淋巴管瘤的一种，主要由于胎儿淋巴系统发育异常，导致淋巴管阻塞扩张所形成的水囊状淋巴管瘤。这种淋巴管发育畸形多于孕早期发生，是孕早期胎儿颈部透明层(nuchal translucency，NT)筛查中最常见的超声异常[1]。CCH的发生与染色体异常及Noonan 综合征、胎儿酒精综合征等遗传性综合征相关[2]。染色体核型分析可检测出染色体数目和结构异常，是诊断胎儿染色体异常的“金标准”，但无法检测小于5 Mb的拷贝数变异(copy number variation，CNV)。染色体微阵列技术(chromosome microarray analysis，CMA)因其高分辨率的检测能力，可以检出亚微观的CNV，同时，也可以检出染色体非整倍体、大片段缺失与重复，目前已常规应用于产前诊断，其主要技术包括单核苷酸多态性微阵列(single nucleotide polymorphism array,SNP array)、比较基因组杂交微阵列(array comparative genomic hybridization,aCGH)和低深度全基因组拷贝数变异测序(copy number variation sequencing,CNV-seq)[3]。与其他两种技术相比，SNP array还能检出多倍体、杂合性缺失和单亲二倍体，近年来已经广泛应用于胎儿超声结构异常的产前诊断[4]。本研究采用SNP array和染色体核型分析对 170 例经产前超声诊断为胎儿CCH的孕妇进行产前诊断，探讨胎儿CCH与染色体异常的关系，并分析SNP array联合染色体核型分析在胎儿CCH产前诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2021年5月在广西壮族自治区妇幼保健院经超声诊断为CCH的胎儿170例纳入本研究，其中单胎样本155例，15例为双胎样本。经孕妇知情同意后，采集绒毛、羊水或脐血样本进行遗传学分析，所有样本均进行了SNP array检测，由于细胞培养失败，有5例样本未进行染色体核型分析。所有纳入研究的孕妇年龄19～47岁，平均(31±6)岁，中位数为31岁；孕周11～32周，平均(16±5)周，中位数为13周。

1.2 CCH的超声检查

使用彩色多普勒超声诊断仪，根据英国胎儿医学基金会(Fetal Medicine Foundation,FMF)产前超声检查方法[5]，对孕妇腹部进行超声扫查，测量胎儿顶臀长、NT厚度、胎儿颈项部软组织厚度，同时按胎儿标准化超声筛查切面运用连续顺序追踪超声扫查法进行扫查及观察胎儿颅内结构、鼻骨、心脏、胃泡、膀胱、脐带腹壁入口、双侧上下肢等大体结构。

1.3 染色体核型分析

针对超声检查诊断为CCH的胎儿，孕妇知情并签署同意书后，对于孕早期孕妇，在B超引导下，经腹部穿刺获取胎儿绒毛；对于孕17～22周的孕妇，经腹羊膜腔穿刺术抽取20 mL羊水，其中，10 mL直接进行DNA提取，另外10 mL用于染色体核型分析；对于孕周>22周者，经皮脐静脉穿刺术获取1～2 mL脐带血，0.5 mL直接进行DNA提取，剩下的用于染色体核型分析。对获取的胎儿样本进行细胞培养，以秋水仙素阻断细胞有丝分裂，获取中期细胞分裂相，收获制片后进行染色体 G 显带分析。每份标本计数20个分裂相，分析5个核型，若出现嵌合体，计数分析至50个分裂相。参照人类遗传学国际命名体制(ISCN 2016)对染色体核型命名。

1.4 SNP array检测

采用厦门致善生物科技有限公司生产的Lab-Aid 820核酸提取Midi试剂盒(200116)，根据试剂盒说明书，提取脐带血中的基因组DNA；利用天根生化科技(北京)有限公司生产的微量样品基因组DNA提取试剂盒(DP316)提取绒毛和羊水中的基因组DNA。DNA采用Nanodrop2000分光光度计测定DNA浓度及纯度。采用illumina公司的HumanCytoSNP-12芯片进行SNP array分析，根据标准操作流程对基因组DNA依次进行全基因组扩增、片段化、杂交和荧光染色，采用illumina公司的iScan芯片扫描仪对制备的基因芯片进行扫描，获得的数据通过KaryoStudio1.4.3软件进行分析。通过与DGV、ISCA、OMIM、DECIPHER、ClinVar等数据库进行比对分析，根据染色体微阵列分析相关指南，将所检出CNV进行致病性分类：① 致病性CNV；② 可能致病性CNV；③ 临床意义不明CNV；④ 可能良性CNV；⑤ 良性CNV。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22软件进行数据分析，孕妇年龄和孕周采用平均值、标准差和中位数进行描述,率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体核型分析结果

165例CCH胎儿中，6例检出核型多态，61例检出染色体异常。染色体异常包括：57例染色体数目异常(34.5%，57/165)：26例特纳综合征(15.8%，26/165)，其中1例伴有7p22q22的倒位，1例为特纳综合征嵌合体(嵌合比例约为10%)；16例21-三体综合征(9.7%，16/165)；12例18-三体综合征(7.3%，12/165)；1例13-三体综合征(0.6%，1/165)；1例47,XXX综合征(0.6%，1/165)；1例为15号染色体三体的嵌合(嵌合比例约为4%)。4例染色体结构异常(2.4%，4/165)：3例易位；1例为18号染色体长臂的等臂染色体的嵌合。详见表1。

2.2 SNP array检测结果

170例CCH胎儿中，71例检出染色体异常，包括：59例染色体数目异常(34.7%，59/170)：27例特纳综合征(15.9%，27/170)，其中1例伴有致病性CNV(arr[hg19]16p11.2(29656093_30332203)x1)，1例为特纳综合征嵌合体(嵌合比例约为60%～80%)；17例21-三体综合征(10%，17/170)，其中1例伴有8号染色体三体的嵌合(嵌合比例约为10%～20%)；12例18-三体综合征(7%，12/170)；1例13-三体综合征(0.6%，1/170)；1例47,XXX综合征(0.6%，1/170)；1例为15号染色体三体的嵌合(嵌合比例约为10%～20%)。

除1例特纳综合征伴有致病性CNV外，在12例CCH胎儿中检出了12种不同的CNV(7.1%，12/170)，其中有10例为致病性CNV，检出率为5.9%(10/170)，2例为临床意义不明的CNV。详见表1。

10例致病性CNV的胎儿中，有3例均检测到两个致病性CNV；3例检测到16p13.3区域约0.05 Mb的纯合缺失，包含HBA1基因与HBA2基因，可导致α地中海贫血症；1例DiGeorge综合征；1例为3q22.1q29区域约65.2 Mb的重复；1例检测到Xp21.1区域约0.16 Mb的纯合缺失，包含DMD基因第46-50号外显子，可导致假肥大性肌营养不良；1例检测到20p13p12.3区域约6.8Mb的嵌合重复，但由于嵌合比例较低，且样本为绒毛，孕中期重新抽羊水检测，结果正常。另有2例胎儿检测到的微缺失或微重复被评估为临床意义不明CNV，1例为17p11.2区域约1.6 Mb的微重复，包含GRAP、ALDH3A2、AKAP10和B9D1等OMIM数据库中明确致病的基因和13个未明确疾病的OMIM基因，以及其他30多个蛋白质编码基因；另1例为16p13.3区域约0.6 Mb的微缺失，包含1个OMIM致病基因RBFOX1，该基因的pHI分值为0.33%，提示其可能为单倍剂量不足基因。

2.3 两种方法检测结果的比较

170例样本均成功进行了SNP array检测。染色体核型分析中，5例样本细胞培养失败，因此只有165例进行了G显带的染色体核型分析。所以单独采用SNP array对染色体异常的检出率为41.8%(71/170)，而单独采用染色体核型分析的异常检出率为37.0%(61/165)，两者比较差异无统计学意义(χ2=0.351，P>0.05)。两者联合对染色体异常的检出率为41.8%(71/170)，与单独SNP array和染色体核型分析相比，差异无统计学意义(χ2=0.119、0.231，P>0.05)。

除了细胞培养失败的样本外，两种方法都成功检出所有的染色体数目异常，但存在嵌合比例的差异。对于1例核型分析为特纳综合征的胎儿，SNP array除了检测到特纳综合征外，还检测到1个致病性CNV。此外，染色体核型分析检出的3例易位及1例等臂染色体，SNP array均检测到致病性CNV。

对于5例细胞培养失败的样本，SNP array检测到2例为染色体数目异常，分别为特纳综合征和21-三体综合征。同时，在98例染色体核型分析未见异常的CCH胎儿中，SNP array检出8例CNV，增加了4.7%(8/170)的检出率。

3 讨论

胎儿的淋巴系统自孕6周由原始淋巴囊开始发育，至孕9～10 周，所有原始淋巴囊贯通，形成淋巴体系，从淋巴主干上向各个方向生长出淋巴管，淋巴管随着血管系统进入各组织[6]。由于淋巴系统发育缺陷，或其他原因导致胎儿静脉压升高，淋巴回流障碍时，可引起胎儿NT显著增厚，表现为胎儿颈部直至全身的水囊样改变[7]。CCH在胎儿发育异常中较为常见，其在出生的胎儿中发病率约为1/1 000～1/6 000，在流产胎儿中发病率高达1/750[8]。目前的研究显示，CCH的预后不良，与胎儿染色体异常、先天性结构异常、围产期死亡显著相关[9]。随着超声技术的广泛开展，越来越多的淋巴水囊瘤胎儿得以在妊娠早期被检出，同时及时行介入性产前诊断查找可能的病因，为是否终止妊娠提供最有力的依据。本研究采用染色体G显带和SNP array技术对170例CCH胎儿进行介入性产前诊断，染色体异常率为41.8%。其中，染色体非整倍体异常率为34.7%，以特纳综合征最常见，其他的非整倍体分别为21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征、47,XXX综合征和15号染色体三体的嵌合，与相关文献报道的数据基本一致[9-10]。

染色体亚显微层面结构异常引发的出生缺陷，临床表型的严重性不亚于染色体显微层面上数目或者结构异常，而CMA的革命性发展，为检测这种亚显微染色体异常提供了一种新方法[11]。本研究采用SNP array技术对170例CCH胎儿进行检测，除1例为特纳综合征伴有致病性CNV外，还在12例CCH胎儿中检出了12种不同的CNV。其中有4例样本的染色体核型分析也检出了异常核型，2例胎儿的染色体核型分析检测到易位，但对其大小和致病性无法评估，而SNP array检测到相应2个片段的缺失和重复，均被评估为致病性CNV；1例检出46,XN,der(20)t(3,20)(q22,p13)的胎儿，但其SNP array只检测到3q22.1q29区域约65.2 Mb的重复，包含3q29微重复综合征所在区域；1例胎儿的染色体结果提示长臂的等臂染色体的嵌合(46,XN,i(18)(q10)[22]/46,XN[28])，而SNP array发现两处异常，18p11.32p11.21片段的微缺失包含单倍剂量敏感的TGIF1基因，与前脑无裂畸形相关，18p11.21q23片段的嵌合重复在数据库中可查询到大量类似片段重复的病例报道，但由于嵌合比例较低，在进行遗传咨询时，应谨慎评估其临床表型。因此，对于胎儿染色体异常情况，SNP array不仅可以准确地定位，还可以准确地判读其大小，进一步明确该异常是否包含剂量敏感性基因，是否会打断编码基因，从而精准地评估胎儿的临床表现和预后，为遗传咨询和临床干预提供了可靠的信息。

同时，另外8例存在CNV的CCH胎儿中，染色体核型分析未检出异常。因此，SNP array增加了4.7%的检出率。在这8例胎儿中，6例胎儿检出的为致病性CNV，2例胎儿检测到的微缺失或微重复被评估为临床意义不明CNV，但因为其包含的基因可能与疾病相关，对于遗传咨询和进一步追踪随访提供了理论依据。

本研究中，单独使用染色体核型分析在CCH胎儿中的检出率为37.0%；单独使用SNP array的检出率为41.8%，两种方法的检出率差异无统计学意义。SNP array与染色体核型分析联合检测虽然未显著增加染色体异常的检出率，但两者的联合使用可进一步了解染色体的异常。如染色体核型分析可检出易位、倒位和等臂染色体等染色体结构异常，可帮助详细了解CCH胎儿的染色体异常，为遗传咨询提供可靠的依据；而SNP array可检出小片段(<5 Mb)的微缺失与微重复，增加一定的检出率[12]。同时，对于染色体核型分析发现的结构异常，采用SNP array可以进一步明确染色体异常区带拷贝数的变化及可能包含的致病基因等。此外，对于细胞培养失败的胎儿样本，无法进行染色体核型分析，但SNP array不需要进行细胞培养，因此，可以为生长较差的细胞以及存在嵌合体的细胞提供真实的检测结果[13]。因此，染色体核型分析与SNP array的联合使用，可以相互弥补各自的不足。

综上所述，经B超检测到CCH的胎儿，染色体异常发生率较高，以非整倍体为主，但也存在染色体核型分析才能检出的易位等染色体结构异常，以及需要SNP array等染色体微阵列分析才能检测到的致病性CNV。因此，针对B超诊断为CCH的胎儿，同时进行染色体核型分析和SNP array检测，可以使检测到的染色体异常结果得到验证，同时，又能够互为补充，从而为CCH胎儿的遗传咨询、预后评估以及临床干预提供全面和准确的信息。