不同细胞来源外泌体对眼表的作用研究进展

康艺龄 综述 赵少贞 审校

天津医科大学眼科医院 天津医科大学眼视光学院 天津医科大学眼科研究所 国家眼耳鼻喉疾病临床医学研究中心天津市分中心 天津市视网膜功能和疾病重点实验室，天津 300384

外泌体是细胞分泌的膜性囊泡，膜上的突起是膜蛋白，与靶向结合有关，内容物主要是脂质、蛋白质和核酸[1]。探索不同细胞来源的外泌体功能和特点对不同疾病的诊断和治疗有研究价值。目前，对不同细胞分泌的外泌体作用于眼表疾病的认识还不全面，本文就不同细胞分泌外泌体的特点及其作用于眼表疾病的研究进行综述。

1 外泌体的生物学特点

细胞分泌体不仅含有可溶性蛋白，还含有胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，如外泌体。细胞膜内陷形成胞内小泡，随后发育成早期内吞小体、晚期内吞小体，向内出芽形成多囊泡体，多囊泡体的腔内小泡被分选以供货物降解，或以外泌体的形式分泌到细胞外环境中[2]。由于没有完美的方法仅能分离外泌体，因此，在本综述中提到的术语EVs用于描述富含外泌体的囊泡。

2 不同细胞来源外泌体的特点与眼表疾病

几乎机体所有细胞均可产生外泌体，种类不同的细胞或处于不同状态下的细胞所释放的外泌体不同。与眼表疾病相关的常见外泌体的细胞来源有间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)、未成熟树突状细胞(immature dendritic cell，imDC)、髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)等。

2.1 MSC及其外泌体

眼表疾病的研究中，MSC来源的外泌体(mesenchymal stem cell derived exosome，MSC-exo)研究较多，特别是从骨髓、脂肪、脐带、角膜中分离出的MSC。MSC是起源于中胚层，具有多向分化、自我复制和抗炎、免疫调控等特点的多能干细胞，易于从多种易获得的组织中分离，可大规模体外培养，免疫原性低。MSC的性能因不同组织来源而异。骨髓来源的MSC(bone marrow derived MSC，BM-MSC)数量及其分化潜能随着年龄的增长而急剧下降，分离过程具有侵入性且受试者感受痛苦[3]。从获取难易程度来看，脂肪来源的MSC(adipose-derived stem cell，ADSC)比BM-MSC更有优势，因为皮下脂肪组织来源广泛，可方便、重复获取，分离过程简单且为微创[4]。与BM-MSC和ADSC相比，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC)具有培养时间更长、增生能力强、延迟衰老以及抗炎作用更强的特点[5]，其含量较高，增生和免疫调节能力强，且取材方便，无伦理、配型、排斥反应等问题。近年发现角膜也可分离出MSC。角膜中央分离的角膜基质来源的MSC(corneal stroma-derived mesenchymal stem-like cell，CSMSC)可表达MSC相关的表面标志物。CSMSC在体外可以分化为脂肪、骨和软骨，其基因表达谱更接近BM-MSC，而不是角膜缘上皮干细胞[6]。角膜缘基质的角膜基质干细胞(corneal stromal stem cell，CSSC)也表现出与MSC相似的特性，保持MSC标记阳性染色[7-8]。角膜上皮、角膜成纤维细胞也可分泌外泌体作用于眼表。大量的实验和临床研究表明，大部分MSC介导的有益效应归因于MSC-exo作用，MSC-exo的治疗潜力依赖于生物活性分子，包括脂质、蛋白质和微小RNA(microRNA，miRNA)。MSC-exo能有效抑制炎性M1巨噬细胞的效应功能，减轻DC的抗原提呈特性，抑制炎性CD4+Th1和Th17淋巴细胞的产生，诱导Treg、耐受性DC和交替激活的巨噬细胞扩增，有助于减轻持续的炎症反应[9]，并促进组织修复和再生。

2.1.1角膜损伤 当角膜受到热力、化学伤害、外伤等刺激时，角膜缘上皮干细胞分化为上皮细胞，并向角膜中央迁移恢复角膜透明性。角膜基质由细胞外基质和胶原组成，基质细胞位于细胞外基质中，胶原纤维的规则排列对维持角膜透明性有重要作用。残存的角膜基质细胞分化为角膜成纤维细胞或肌成纤维细胞，胶原纤维排列失去规则性，导致角膜瘢痕。

MSC促进组织修复的作用来源于产生外泌体的旁分泌途径而非直接转分化逐渐被认识到。不同来源的MSC-exo可促进角膜损伤修复。人角膜缘基质来源的MSC外泌体促进角膜上皮伤口愈合，与角膜中伤口愈合相关信号分子p-Akt的上调有关[10-11]。外泌体来源细胞所处的不同病理生理状态影响着其分泌外泌体的内容物和生物功能。糖尿病和正常人角膜缘基质细胞的外泌体(DM-exo和N-exo)中小RNA差异表达，经N-exo处理后的角膜上皮伤口愈合和增生率显著增加，而DM-exo处理后无明显变化[11]，说明外泌体中小RNA的差异可能与疾病状态有关。ADSC-exo调节角膜中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和胶原蛋白以恢复角膜基质并重塑细胞外基质[12]。ADSC-exo分泌的miR-19a抑制HIPK2表达，而HIPK2的下调抑制了转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad3和p53通路，导致纤维化前标志物和细胞外基质成分的表达降低，从而抑制角膜基质细胞分化为成肌纤维细胞[13]。越来越多的研究一致认为，MSC促进角膜损伤修复不是通过直接分化为角膜上皮细胞，而是通过减少新生血管和炎症反应，培育了一个微环境，从而上调常驻干细胞的增生和分化[14]。CSSC来源的EVs可与角膜细胞融合，将miRNA转移到角膜细胞内，降低纤维化基因Col3a1和Acta2的表达，阻断中性粒细胞浸润，从而减轻小鼠角膜损伤后瘢痕[15]，这些结果提示EVs递送的miRNA在CSSC的再生功能中发挥作用。

角膜透明性有赖于无血管结构，在角膜损伤修复过程中往往伴随着新生血管的生成。MSC有促血管生成和抗血管生成作用，取决于微环境变化。MSC及其条件培养液通过上调基质细胞蛋白凝血酶敏感蛋白-1，减轻损伤角膜的炎症和新生血管[16]。MSC在缺血组织中可促血管生成，通过促进血管内皮细胞增生、迁移，促进血管形成，改善氧供[17]。缺氧条件下激活低氧诱导因子-1α可增强MSC活性和迁移能力，低氧诱导因子-1α过表达的MSC-exo增加了血管生成和血管通透性[17]。角膜成纤维细胞分泌的外泌体可以将包括MMP14在内的蛋白转运到血管内皮细胞[18]，MMP14降解VEGFR1以促进VEGFR2与VEGFA结合从而促进更多的VEGFR2激活和血管生成[19]。所以抑制MMP14和调节含有MMP14的外泌体可能是抑制角膜新生血管的潜在机制。小鼠角膜上皮细胞分泌的外泌体在体外能与角膜基质细胞融合，诱导肌成纤维细胞转化，还可诱导内皮细胞增生[20-21]，这表明上皮细胞来源的外泌体在角膜上皮细胞与角膜基质细胞、血管内皮细胞之间起着中介作用，亦可能参与新生血管形成和角膜损伤修复过程[21]。

2.1.2角膜移植排斥反应 角膜虽有免疫赦免特性，但移植术后排斥反应仍可能导致手术不成功。CD4+T细胞、细胞因子、CD8+T细胞和效应B细胞参与角膜移植排斥反应。细胞疗法(MSC、Treg、imDC、MDSC)对角膜移植排斥有治疗作用[22]。给动物注射EVs，包括来自同种异体MSC、imDC或Treg的外泌体，可延长同种异体移植物的存活时间。BM-MSC通过减少CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞，增强Treg表达，促进同种异体角膜移植的存活[23]。BM-MSC诱导的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、蛋白酪氨酸磷酸酶C型受体、C-X-C基序趋化因子配体9基因上调和热休克蛋白家族A成员8基因的下调可能有助于BM-MSC的保护作用，并保留潜在的介入角膜移植排斥反应的靶点，BM-MSC可能通过调节上述抗原靶点来抑制T细胞介导的免疫反应[23]。联合应用促炎因子TNF-α和白介素(interleukin，IL)-1β可进一步增强BM-MSC的免疫调节能力，促进角膜移植物存活[24]。角膜移植排斥模型大鼠结膜下注射BM-MSC来源外泌体，可通过调节细胞因子，如上调IL-10/干扰素γ水平，降低IL-17水平，调控Th细胞分化，抑制T细胞增生和CD4+T细胞的表达以及上调Treg，延长角膜植片存活时间[25-27]。该研究还通过标记外泌体，观察到结膜下注射BM-MSC来源外泌体可到达角膜和前房，说明外泌体可跨越生物屏障发挥作用[27]。

2.1.3黏多糖贮积症 黏多糖贮积症Ⅶ(mucopolysaccharidosis Ⅶ，MPS Ⅶ)是一种代谢贮积病，归因于编码β-葡糖醛酸糖苷酶的GUSB基因突变。这种溶酶体酶的缺乏会损害人体分解糖胺聚糖的能力。角膜混浊在MPS Ⅶ中很常见。hUC-MSC来源外泌体能与角膜细胞内的溶酶体融合，从而递送活性β-葡糖醛酸糖苷酶并随后分解累积的糖胺聚糖[28]，这提示外泌体对MPS Ⅶ所致角膜混浊有治疗潜力。

2.1.4干眼 干眼是以泪膜稳态失衡为主要特征并伴有眼部不适症状的多因素眼表疾病，眼表炎症与损伤是其病理机制之一[29]。与免疫相关的干眼发病机制为自身泪腺组织的免疫炎症反应，MSC及其外泌体具有免疫调节、抗炎和组织修复能力，故用于干眼的治疗有广阔前景。hUC-MSC来源外泌体升高抗炎因子TGF-β、IL-10等的表达，抑制炎性因子TNF-α、IL-1β的表达，促进巨噬细胞表型转化，减轻干眼角膜上皮的损伤，对干眼有治疗作用[30-31]。泪腺来源MSC的分泌体包含Lcn2、prosaposin、Rac1和STAT1等蛋白，这些蛋白对泪腺上皮细胞存活产生积极影响，并可能诱导泪腺再生[32]。在苯扎氯铵诱导的小鼠干眼模型中，ADSC-exo上调抗炎因子IL-10水平，逆转激活的NLRP3炎性小体和上调的caspase-1、IL-1β、IL-18水平，从而减轻眼表炎症[33]。

2.1.5干燥综合征 干燥综合征(Sjögren syndrome，SS)是一种表现为眼干和口干的自身免疫性疾病，以唾液腺和泪腺的淋巴细胞浸润和多种自身抗体存在为特征。SS患者体外培养的唾液腺上皮细胞释放的外泌体中存在自身抗原Ro/SS-A、La/SS-B以及Sm-RNPs，表明细胞内自身抗原可以通过外泌体进行转运[34]。由于EB病毒主要感染B细胞，EBV-miRBART13-3p通过外泌体从B细胞转移到唾液腺上皮细胞，这种功能性miRNA针对水通道蛋白5和基质相互作用分子1影响唾液分泌[35]。

2.1.6眼部移植物抗宿主病 移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是异基因造血干细胞移植后发生的一种疾病，眼部GVHD主要累及眼表。MSC通过减少CD3+T细胞、Pax6的表达，有效减轻眼部GVHD的角膜炎症和鳞状化生[36]。BM-MSC来源外泌体通过抑制Th17细胞并诱导Treg，保存外周幼稚T细胞来提高GVHD小鼠的存活率并减轻其病理损伤[37-38]。

2.2 Treg及其外泌体

Treg是T细胞的一类亚群，根据其发育来源，可分为直接从胸腺中分化而来的自然Treg和在外周活化过程中产生的适应性Treg。Treg可诱导免疫耐受，直接通过细胞间接触或间接通过分泌毒性分子和IL-10、TGF-β等免疫抑制性细胞因子发挥免疫抑制作用。高表达Foxp3的Treg具有更强的免疫抑制作用。但机体中Treg数量少，难获得，稳定性、效能、纯度等问题待明确。Treg分泌的外泌体中含有多种成分，如膜表面蛋白质分子、RNA和细胞因子等，可与靶细胞高效作用，抑制T细胞增生，发挥其免疫调节作用[39]。

通过直接注射Treg或刺激体内Treg分泌增生可增加体内总Treg数量从而提高角膜移植成功率[40]。Treg可通过释放的高浓度EVs抑制CD8+细胞毒性T淋巴细胞以诱导移植物免疫耐受[41]。Treg分泌外泌体内的miRNA(miR-503、miR-330和miR-9)和诱导型NO合成酶通过干扰细胞周期进程，诱导凋亡和其他T细胞分化为Treg表型，抑制T细胞的同种异体排斥反应[42]。Treg分泌的外泌体对角膜植片亦可能诱导免疫耐受，但尚未见报道。

2.3 imDC及其外泌体

DC是专职抗原提呈细胞，其成熟过程中可分泌外泌体。DC不同的成熟状态有不同的免疫功能。imDC表达低水平的共刺激分子和主要组织相容性复合体Ⅱ类(major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC-Ⅱ)，发挥免疫抑制作用，而成熟DC表达高水平共刺激分子和MHC-Ⅱ，发挥免疫刺激作用。IL-10修饰的供体来源imDC利于角膜植片存活，诱导角膜移植免疫耐受，且比单纯imDC注射时角膜植片存活时间更长[43]。来自imDC的外泌体分泌的miR-682经负调节CD4+T细胞中的ROCK2基因促进Treg分化，诱导模型小鼠移植肾的免疫耐受[44]，其中ROCK2是miR-682的靶标。来自imDC的外泌体亦可能诱导角膜植片的免疫耐受，但尚未见报道。

2.4 MDSC及其外泌体

MDSC是一种异质性的未成熟髓系细胞群体，可产生免疫抑制因子，从而发挥免疫抑制活性，MDSC可用于诱导免疫耐受并延长同种异体移植物存活时间，已经成为移植免疫学研究的重点[45]。角膜移植手术后立即向模型鼠眼眶后注射炎症、肿瘤诱导的MDSC均能抑制CD4+T细胞增生、角膜植片新生血管和炎症细胞浸润，延长同种异体角膜移植物存活时间[46-47]。MDSC来源的外泌体在体外促进Treg扩增，体内则更为明显，可抑制活化的T细胞增生和细胞毒性反应[48]。人类MDSC来源的外泌体在体外过度表达miR-29a-3p和miR-93-5p，可抑制Th1和Th17细胞分化[49]。MDSC来源的外泌体在肿瘤、自身免疫性疾病等方面的作用已有文献报道，但尚无对角膜移植排斥反应的报道。因此MDSC来源的外泌体诱导角膜移植排斥反应的免疫耐受有研究价值。

3 小结

MSC、Treg、imDC、MDSC都可调节免疫反应，其外泌体通过传递蛋白质、核酸等内容物可发挥其来源细胞的生物学作用。通过抑制T细胞增生、转换巨噬细胞表型、调控Th细胞分化、上调Treg表达等机制发挥抗炎和免疫抑制作用，外泌体对眼表免疫相关疾病如角膜移植排斥反应、干眼、SS、眼部GVHD有治疗潜力。外泌体参与角膜损伤的修复，递送活性β-葡糖醛酸糖苷酶并随后分解MPS Ⅶ中累积的糖胺聚糖，减轻患者角膜混浊[14,28]。在众多的外泌体来源中，MSC被认为最有临床应用潜力，且研究最多。不同来源的MSC抗炎、免疫抑制和促进组织修复作用相似，但分离难易程度有所不同。外泌体来源细胞的生理病理状态影响着外泌体功能[11]。不依赖活细胞的外泌体比活细胞更稳定，无免疫排斥、恶变和细胞治疗相关小血管堵塞的风险，从而提高了治疗的有效性和安全性。不同的miRNA、蛋白质由外泌体传递到相应组织发挥作用逐渐被认识到，可为每种眼病定义与外泌体治疗效果相关的精确因子，使其应用于患者之前在外泌体中过表达，从而最大限度发挥疗效。尽管有实验研究显示了外泌体的治疗潜力，但转化到临床仍有很多工作要做，比如如何高效分离纯化外泌体等。

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