嘌呤能信号在干性年龄相关性黄斑变性中损伤作用的研究进展

胡一凡 综述 孙晓东 审校

上海交通大学附属第一人民医院眼科 上海市眼底病重点实验室 上海眼视觉与光医学工程技术研究中心 200080

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是老年人群中重要的致盲眼病之一[1]，主要分为干性AMD和湿性AMD。AMD的发病过程中伴随多种病理改变，其中视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞功能异常和变性是AMD发病早期的关键病理改变之一；光感受器及多种视网膜细胞的死亡是视力下降的直接原因；代谢产物及其他途径来源的物质异常沉积于RPE与Bruch膜之间，形成玻璃膜疣(drusen)；RPE与活化的小胶质细胞参与调控的炎症反应既是AMD的病因，也是AMD进展加速的诱因[2]。目前湿性AMD可采用抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)玻璃体腔注射治疗，但干性AMD发病机制复杂，其仍缺乏有效治愈手段[3]。

近年研究提示嘌呤能信号通路在干性AMD的发生和发展过程中起着重要作用[4]。正常情况下，嘌呤能信号通路参与视网膜多种生理过程[5]，其中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)帮助传递光学信号，同时维持视网膜稳态；腺苷通过调控小胶质细胞的活性，影响视网膜免疫炎症反应；ATP和腺苷的表达平衡，为光感受器细胞发挥正常生理功能提供基础；RPE细胞产生的ATP还能促进视网膜神经祖细胞增生。随年龄增加，视网膜环境发生改变，嘌呤能信号通路异常激活导致视网膜多种细胞功能障碍，产生坏死、凋亡、炎症、氧化应激等损伤反应。近年来，嘌呤能信号通路在AMD的多重身份及功能引起了研究者的广泛关注。深入了解嘌呤能信号通路在干性AMD中的作用机制，可以从全新角度解释并补充AMD的发病机制，为更好地治疗干性AMD提供理论依据。

1 嘌呤能信号通路

1.1 嘌呤能信号通路组成

嘌呤能信号通路由配体腺苷和ATP及其相应受体组成。生理状态下视网膜中嘌呤能分子在无光照条件下释放，随神经活性的增强而增多[6]。

腺苷的产生途径有2种，包括胞内合成后通过不同细胞(如视网膜神经节和Müller细胞)的平衡核苷转运蛋白释放，或在病理条件下通过ATP酶的去磷酸化作用直接在胞外形成。腺苷受体P1是G蛋白偶联型受体，分为A1、A2A、A2B和A3这4种亚型；几乎所有类型的视网膜细胞包括光感受器细胞、神经元(视网膜神经节，无长突细胞和双极细胞)、神经胶质细胞、RPE细胞和周细胞都含有这4种亚型的腺苷受体，但不同种属之间表达存在差异[7]。

ATP也存在多种来源，包括在神经元中通过钙离子(Ca2+)和/或泛连接蛋白途径释放，以及在非神经细胞中，如RPE细胞、胶质细胞，通过Ca2+依赖或非依赖机制释放[8]。ATP受体主要分为离子型P2X受体和G蛋白偶联代谢型P2Y受体，广泛分布在视网膜各层细胞中[9]。

1.2 嘌呤能信号通路功能

嘌呤能信号通路在神经-胶质细胞间起神经递质和胶质递质的作用，参与视网膜中视觉信号和生物信号的传递以及生物过程的调节，包括光感受器细胞与RPE细胞间物质交换，RPE细胞和大胶质细胞(包括Müller细胞，星形胶质细胞)稳态，以及小胶质细胞的活性等[10]。腺苷与ATP介导的嘌呤能信号通路在视网膜中扮演着不同的角色。

作为神经元活动的主要抑制剂，腺苷主要起神经保护作用，通过抑制神经元活动和神经递质释放，保护神经元免于过度兴奋和谷氨酸毒性，已有研究证实腺苷在神经退行性疾病中起保护作用[11]。这种保护作用主要由腺苷受体A2A亚型介导，通过多种抑制性机制发挥作用，包括激活突触前受体抑制电压依赖性Ca2+通道，避免神经递质，如谷氨酸、乙酰胆碱和ATP的过多释放；抑制N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)激活；抑制磷脂酶C(phospholipase C，PLC)活性；促进γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)能信号传导，以及激活ATP敏感性钾离子(K+)通道等[4]。当视网膜缺血缺氧时，腺苷通过激活腺苷受体，介导周细胞松弛，引起视网膜血流增加，改善缺血缺氧视网膜的代谢情况，对视网膜缺血性损伤具有保护作用[12]。

ATP作为兴奋性神经递质，负责介导快速神经传导，参与细胞的能量供应和代谢，调控细胞之间的信号传递。视网膜中的ATP常作为信号传递和下游通路的中央调控者，调节视网膜稳态。ATP的受体P2X有7个亚型，P2Y有8个亚型，分布在视网膜各层细胞，参与多个突触水平的信号传导[9]。不同亚型受体发挥的作用不同。位于大多数视网膜神经元上的P2X受体可以促进快速兴奋性神经传递，如细胞凋亡，细胞分化和增生以及胚胎发育等过程；而位于神经元、神经胶质细胞和RPE细胞上的P2Y受体主要起神经调节作用，如小鼠视网膜中的视觉信息处理，视杆和锥体途径的受体后调节等[13]。当视网膜处于长期应激状态时，大量释放的内源性ATP主要产生神经毒性作用，可能导致多种细胞死亡。

2 嘌呤能信号通路在干性AMD中的作用

AMD的主要病理特征为RPE细胞的病理改变和光感受器细胞的损失。在85%～90%的干性AMD患者中，首先形成大面积融合性drusen，伴随RPE细胞变性的功能障碍以及细胞死亡，失去营养支持的光感受器细胞开始凋亡，小胶质细胞及Müller细胞活化后过度聚集，加重炎症反应[14]。大量视网膜细胞死亡，脉络膜毛细血管萎缩，视网膜相应区域形成地图样萎缩(geographic atrophy，GA)，最终导致视力下降[3]。越来越多研究提示，上述病理过程均涉及嘌呤能信号通路，由嘌呤能受体、配体充当信号转导的中介，诱导视网膜细胞发生生理和退行性改变。

2.1 调控视网膜细胞死亡

嘌呤能信号通路中的ATP调控主要参与AMD发病过程中视网膜细胞死亡，针对性减少ATP的释放或选择性抑制ATP受体的活性可能对干性AMD的病理过程起到保护作用。

AMD发病过程中P2X受体，特别是P2X7受体的激活，是诱导视网膜细胞死亡的关键步骤。研究发现，激活RPE上ATP受体P2X7及更多P2X亚型受体，Ca2+信号传导异常，导致细胞凋亡。使用P2X7受体的不可逆抑制剂——氧化的ATP或拮抗剂亮蓝G和KN-62，能够阻断或显著抑制RPE细胞凋亡，提示过度激活嘌呤信号通路可能促进RPE细胞死亡，促进干性AMD中GA的发展[15]。P2X7受体被激活后还可诱导形成大的质膜孔，这些质膜孔通过激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体，诱发炎症小体依赖性细胞死亡途径，即细胞焦亡，一种新型的程序性细胞死亡[16]。除RPE细胞外，P2X7受体信号通路还能够诱导光感受器及神经元等多种细胞的死亡。当发生细胞应激及慢性炎症时，大量细胞外ATP通过P2X7受体诱导光感受器细胞凋亡。P2X7受体拮抗剂亮蓝G能够通过拮抗P2X7受体阻止光感受器细胞凋亡，可用于保护光感受器细胞、神经元和微血管内皮细胞免于变性死亡。亮蓝G目前已获批应用于眼科手术，用于眼内特定组织的染色步骤，例如在玻璃体切除术中对内界膜染色以便于剥除内界膜，但迄今尚未有关于该药物长期治疗效用的研究报道[17]。由于AMD存在多种细胞死亡途径，我们仍需确定体内应用P2X7受体抑制剂是否能保护视网膜细胞免于死亡，或者是否必须同时联合多种细胞死亡途径抑制剂才能获得最佳神经保护作用。

ATP受体的另一亚型P2Y受体信号通路在受损的视网膜中同时具有神经毒性和神经保护性的双重作用。大胶质细胞和RPE细胞中的P2Y受体被激活后通过参与视网膜炎症反应，诱导细胞中Ca2+水平升高，P2Y受体的过度激活导致细胞毒性的钙超载，促进细胞死亡[18]。同时，P2Y1激活不仅能促进视网膜祖细胞增生[19]；在敲除P2Y1受体基因的小鼠中还会发生缺血性视网膜病变，诱导视网膜全层细胞凋亡，其中光感受器的损伤更为明显，表明P2Y1信号传导对细胞存活的必要性[20]。P2Y受体对视网膜细胞的双向调节作用值得进一步探索。

2.2 调节小胶质细胞活性和功能

小胶质细胞作为视网膜免疫系统中的常驻巨噬细胞，其活化募集程度与AMD的发展和严重程度相关。AMD的病理标志物drusen的成分，如补体蛋白、脂褐素、β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)等长期刺激小胶质细胞会激活补体系统和炎症小体通路，导致慢性炎症和细胞变性[21]。因此，补体系统和炎症小体通路是防御AMD中炎症反应与组织变性的关键内在免疫，中心环节是小胶质细胞。小胶质细胞的活化过程由嘌呤能神经信号和胶质信号共同传导调控。嘌呤能信号通路中腺苷和ATP均参与调节小胶质细胞的活性。

腺苷主要通过激活腺苷A2A受体(A2AR)调节小胶质细胞反应性。在不同病理条件下，A2AR会产生促炎或抗炎的作用。糖尿病视网膜病变小鼠模型中，激活小胶质细胞A2AR触发的信号可以阻断肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)释放，并防止小胶质细胞形态活化[22]。而在一些缺血小鼠模型中，阻断A2AR可能减弱小胶质细胞活化，并抑制缺氧和脂多糖诱导下小胶质细胞释放TNF-α，对ARPE-19细胞中NLRP3炎症小体和补体的激活作用也减弱，推测其具有抗炎作用[23]。许多抗炎因子通过抑制嘌呤能通路发挥抗炎功效，如大麻二酚能够通过抑制腺苷摄取和A2AR激活，抑制视网膜小胶质细胞的活化[24]。A2AR拮抗剂SCH58261不仅抑制小胶质细胞活性，还能阻止下游补体的激活和促炎介质的上调，提高凋亡光感受器细胞的清除率，促进祖细胞增生，从多种途径保护视网膜[25]。继续深入研究A2AR的作用，调节小胶质细胞，RPE细胞和视网膜其他细胞之间的相互作用，有助于开启未来多途径治疗AMD的可能。

ATP既能调节小胶质细胞的活性，又能够影响小胶质细胞的功能。通过结合细胞上P2Y受体，ATP介导视网膜小胶质细胞形态、运动和吞噬能力，甚至能够诱导小胶质细胞增生[26]。同时，ATP结合P2X7受体能够通过蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein，MAP)途径活化小胶质细胞，促进TNF-α和白介素(interleukin，IL)-1β的释放，激活下游炎症通路，加重炎症反应[27]。体外细胞实验也证实，ATP刺激原代小胶质细胞释放IL-6、TNF-α和单核细胞趋化蛋白-1等促炎因子；当敲除P2X7受体基因后，小胶质细胞不再释放促炎因子[28]。说明抑制P2X7受体可能是抑制炎症及控制AMD的有效靶点。ATP还参与小胶质细胞的其他功能调控。ATP长时间激活P2X7受体会形成大的P2X7孔，抑制小胶质细胞增生并诱导细胞凋亡[29]。病理条件下小胶质细胞大量释放ATP，可能导致光感受器和神经元的退化，并促进视网膜组织的局部损伤区域扩大。因此，选择性抑制P2Y和P2X7受体，可以抑制小胶质细胞的迁移、增生和活化能力，阻止变性区域扩散；而促进ATP表达，激活P2Y和P2X7受体可能通过诱导小胶质细胞凋亡，进而抑制炎症反应。ATP及受体的双向功能研究还有待深入。

此外，嘌呤能信号通路还可调节小胶质细胞的核苷酸代谢，对视网膜产生保护作用。小胶质细胞的年龄相关性功能改变也可能参与视网膜细胞的死亡和炎症机制。目前关于嘌呤能信号通路在干性AMD的发生和发展过程中作用的研究仍存在一定局限性，有待于更多的细胞实验和动物模型进一步探讨。

2.3 调节炎症及病理标志物生成等损伤反应

AMD发病过程中还涉及许多其他病理改变，包括氧化应激和炎症、脂褐素和drusen的形成、视网膜水肿等。这些病理改变的发生与嘌呤能信号通路有关。若能在疾病发展初期选择性抑制嘌呤能信号通路，可能会从多个角度阻止AMD进一步发展。

氧化应激是脂褐素和drusen生成的重要过程，而NLRP3炎症小体是氧化应激和炎症的关键参与者。活化小胶质细胞释放的因子可以直接诱导ARPE-19细胞中NLRP3炎症小体的激活。NLRP3炎症小体又可以反向诱导小胶质细胞释放神经毒性因子如TNF-α、IL-1β、氧和氮自由基，Fas配体等参与补体系统以及炎症小体通路的激活与募集，诱导慢性炎症反应，促进光感受器细胞、RPE细胞以及视网膜神经元的变性[15]。同样作为NLRP3的激活剂，P2X7受体在mRNA和蛋白质水平上调节NLRP3的表达[30]。在P2X7受体被激活期间，会出现沿浓度梯度的K+外流和Ca2+内流。K+外流可有效刺激半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine-aspartic proteases-1，caspase-1)活化和IL-1β前体释放，进而促进NLRP3炎症小体的活化。单独对RPE细胞进行缺氧处理或诱导视网膜缺氧时，RPE细胞和视网膜其他细胞均可释放ATP，通过自分泌或旁分泌方式结合RPE的P2X7受体，启动NLRP3炎症小体转录使之活化并聚集到特定区域，加重炎症反应[31]；反转录转座子编码的Alu RNA通过激活P2X7受体刺激NLRP3炎症小体、caspase-1和IL-18的表达，诱导干性AMD中RPE的变性[32]。P2受体其他亚型也参与了炎症反应：P2Y受体活化诱导RPE细胞中的Ca2+信号通路[33]；P2Y1受体参与炎症小体的启动和活化，通过激活caspase-1，促进IL-1β和IL-18成熟和释放[34]；ATP还可以直接作用于P2Y2和P2Y6，诱导IL-8的合成分泌，或间接通过诱导RPE细胞表达TNF-α增加来诱导IL-8的分泌[35]。氧化的ATP能够消除ATP诱导的免疫细胞释放IL-1β，是对抗炎症的有效方法[36]。广泛用于治疗艾滋病的核苷逆转录酶抑制剂还可以抑制P2X7受体介导的RPE变性和脉络膜新生血管形成，有望成为治疗P2X7受体驱动疾病的药物[32]。新近研究发现，dursen的主要成分之一Aβ寡聚体(AβO)能够通过激活小鼠RPE的P2X7受体诱导NLRP3炎症小体的激活，这是AβO诱导RPE变性的必要条件[37]。以上研究体现了嘌呤能信号通路与NLRP3炎症小体激活的关系，揭示嘌呤能信号通路在AMD病理进程中一系列损伤反应的作用。

AMD的病理标志物drusen由多种成分组成。研究发现，细胞外ATP和腺苷的平衡改变能够调节RPE细胞中溶酶体pH，从而改变溶酶体活性，影响脂褐质的产生[38]。P2X7受体被激活可导致RPE细胞中的溶酶体pH升高，细胞向自噬的转换减少；向RPE细胞中加入光感受器细胞外节(photoreceptor outer segment，POS)碱化溶酶体，脂褐素表达增加；阻断P2X7受体后，细胞中脂褐素形成减少，提示P2X7受体激活导致溶酶体碱化，溶酶体发生功能障碍，脂质氧化水平增加，RPE吞噬功能减弱。同时，RPE细胞中P2X7受体的激活还导致被吞噬的POS脂质氧化增加，吞噬体清除率降低，造成细胞内脂褐素和细胞下含脂蛋白的drusen积聚。另外，通过敲除超氧化物歧化酶-1(superoxide dismutase-1，SOD-1)基因，小鼠表现出慢性氧化应激及类似AMD的特征[39]。同时SOD-1基因敲除小鼠的RPE细胞释放的内源性ATP增多；而敲除P2X7受体基因后，SOD-1基因敲除小鼠的类AMD缺陷和单核/吞噬细胞聚集现象均减轻。结合以上文献，推测P2X7受体过度激活可能是drusen的产生机制之一。除上述病理表现，视网膜水肿也是AMD重要的病理改变。长期大量细胞外液体潴留将影响神经细胞的营养状况、功能与存活。研究显示，敲除P2X7受体基因小鼠的免疫细胞吞噬能力显著低于野生型小鼠；在12月龄时，P2X7受体基因敲除小鼠出现Bruch膜增厚和视网膜色素上皮功能障碍；到18月龄时，P2X7受体基因敲除小鼠表现出与早期AMD一致的表型特征，包括Bruch膜增厚，RPE细胞缺失，视网膜功能缺陷和视网膜下炎症等症状[40]。因此P2X7受体在调控细胞吞噬功能的作用不容忽视。还有研究者发现，使用药物激活P2Y2受体可以刺激RPE细胞产生液体清除作用，促进RPE细胞吸收视网膜下液，从而帮助重建视网膜和RPE之间的正常解剖结构。活化的P2Y2受体可诱导RPE细胞中Ca2+途径激活，导致跨膜离子传递速率升高，从而提高视网膜下液的清除率[41]。这些研究提示，嘌呤受体激活导致离子通道打开，是提高视网膜胶质细胞和RPE细胞水肿消除能力的关键步骤，可以防止视网膜水肿的发生。

综上所述，嘌呤能信号通路在干性AMD的病理过程中发挥着许多作用，参与RPE、光感受器等多种视网膜细胞的死亡诱导、小胶质细胞的活化调节、病理沉积物的生成以及炎症和氧化应激等多个损伤机制的调控。然而目前对于嘌呤能信号通路的研究尚不完善，缺乏良好的动物模型以及多通路的共同调控研究。明确嘌呤能信号通路在干性AMD中的参与机制，能够为研究和完善干性AMD治疗靶点提供新思路，从而更好地保护视网膜细胞，对维持视功能具有重要的临床意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突