角膜力学生物学的研究进展

薛超 王雁

生物力学是研究生命体运动和变形的学科，是应用力学原理和方法对生物体中的力学问题定量研究的生物物理学分支，主要通过生物学与力学原理方法的有机结合，认识生命过程中的规律，解决生命与健康领域的科学问题[1]。随着细胞和分子生物学的发展，生物力学的研究已从器官、组织水平深入到细胞、分子、基因水平，由此产生了一门新兴的交叉学科——力学生物学。

力学生物学是探讨力学环境（刺激）对生物体健康、疾病或损伤的影响，研究生物体的力学信号感受和响应机制，阐明机体的力学过程与生物学过程如生长、重建、适应性变化和修复等之间的相互关系[2]。其通过理解力传导-细胞感知和响应力信号的分子机制从而关注细胞和组织的物理力和力学特性的变化是如何促进发育、细胞分化、生理学和疾病的方面。此外，对组织调节的力学基础的深入了解也可能引导用于组织修复和重建的医疗器械的改进、生物材料和工程化组织的发展。

除了作为重要的屈光系统组成成分、对眼内容物提供保护，人眼角膜还是承载组织，具有独特的生物力学特性。疾病、外伤、手术、配戴角膜接触镜均会引起角膜形状的改变进而影响成像质量，了解及预测角膜对外在改变的反应具有重要的临床意义。因此，近年来角膜生物力学逐渐受到重视，已成为研究的热点，而角膜的力学生物学研究相对较少。现就近年来角膜力学生物学研究现状及进展，进行阐述。

1 角膜的组织学和力学基础

1.1 角膜解剖组织学及生物力学特性

角膜在组织学上分为5 层，由前向后依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层。上皮层被认为对角膜生物力学没有作用或仅有极小的作用[3]。前弹力层是一层薄的弹性基底膜，其对于角膜生物力学的作用存在争议，有研究表明去除前弹力层并不改变角膜力学属性[4]。基质层占角膜总厚度的90%，是承受角膜载荷起主要作用。基质层的胶原纤维成分和纤维结构决定了角膜生物力学弹性性能[3]。后弹力层是角膜内皮细胞的基底膜，有限元评估表明前弹力层和后弹力层占20%角膜的弯曲刚度[5]。内皮层为一单层细胞层，由六角形细胞构成，其机械屏障作用及离子泵功能是维持角膜相对脱水状态的关键，这一层可能通过调节角膜的水合作用而影响角膜的硬度[6]。

1.2 角膜基质细胞和细胞外基质

正常角膜基质层主要由大量胶原纤维板层构成，其中包含了角膜基质细胞、蛋白多糖等成分。角膜基质细胞是一种成纤维细胞，位于基质板层中，作为基质层的最主要细胞成分，调控着基质成分的合成和降解。一方面，角膜基质细胞合成分泌多种结构性蛋白规则排列构筑起纤维网架结构，和蛋白多糖成分协助纤维间的连接组装。另一方面，角膜基质细胞可合成多种酶类，参与调控角膜基质的合成及降解[7]。

细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）由角膜基质细胞分泌，其赋予角膜一定的张力和韧性以保护眼内容物，同时在维持角膜的透明特性以及发挥屈光功能方面也起着重要的作用。细胞外基质对细胞起机械支持与连接作用，同时作为细胞之间信号传递的桥梁，调节细胞的增殖、分化、黏附、扩散、迁移等生理过程，参与炎症的发生及扩散、肿瘤浸润及转移等病理过程[8]。

2 角膜力学生物学的作用机制

力学刺激是细胞生物学功能的重要决定因素，其在决定组织命运或病理状态过程中与化学刺激同等重要。人体活细胞在整个生命过程中不间断地承受各种力学刺激，体外环境和体内生理条件的改变会引起应力和应变改变。而细胞能够根据力学刺激的强度、方向和分布做出多种响应[9]。理解细胞如何响应力学刺激，可进一步研究这些力学信号传播和分布而最终转化成细胞内生物学和化学响应，即力学-化学转导。角膜基质层是承载应力的主要结构，角膜基质细胞是角膜力生物学的主要研究对象[10]。在角膜受到外在的力学刺激或自身受力状态发生改变时，角膜基质细胞可能对力学刺激作出感受、响应，接受到力信号的细胞可能发生某些生物学行为改变，如细胞形态、增殖凋亡状态、基质合成和降解分子表达情况发生变化，并与其周围环境相互作用，使角膜组织发生相应的生物学和力学改变[11]。

在成年人角膜组织中，角膜基质细胞处于静止状态，不表达压力纤维或产生大量的收缩力。不同的临床状况会引起角膜基质结构和力学性能的变化，从而引起角膜基质细胞的响应[12]。受伤、手术后或受到其他刺激后，角膜基质细胞可被伤口周围的生长因子和其他细胞因子激活并转化为成纤维细胞[13]。角膜成纤维细胞增生，形成细胞内应力纤维，迁移至伤口，通过机械力作用对细胞外基质进行重组。在特定的伤口中，转化生长因子β-1（Transforming growth factor beta-1，TGFβ1）可诱导角膜成纤维细胞转变成肌成纤维细胞，从而分泌α平滑肌肌动蛋白（Alpha smooth muscle actin，α-SMA），对基质产生较强的牵引力，合成纤维化细胞外基质[14]。

角膜和泪液中存在的肽生长因子，例如胰岛素生长因子（Insulin growth factor，IGF）、血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）、成纤维细胞生长因子（Fbroblast growth factor，FGF）、白介素1α（Interleukin 1 alpha，IL-1α），肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）和TGFβ可以调整角膜基质细胞的表型，在角膜伤口愈合过程中起到了重要作用[13]。在细胞培养中，这些生长因子可以差异性地调节角膜基质细胞的增殖，细胞骨架构成和ECM合成[15]。细胞表型的变化通常与细胞力学行为的变化相关。例如，在无血清条件下，IGF和PDGF可以刺激3-D基质内角膜基质细胞的伸长，但不会刺激产生显著的力。与此相反，应力纤维形成和显著的基质压缩表明TGFβ可增加角膜基质细胞的收缩[13]。

细胞对可溶性生长因子和（或）生物物理环境的力学变化响应受许多复杂的信号传导通路的调节。在某些情况下，作用于细胞膜的力可以通过核骨架和细胞骨架复合物的连接体（Linker of nucleoskeleton and cytoskeleto，LINC）将肌动蛋白细胞骨架和核相耦合，直接诱导核结构的变化[16]。下游关键信号级联反应的活性变化整合素，特别是Rho和Hippo信号通路能够调节细胞对生长因子的力学分化。小GTPases（例如Rho、Rac和Cdc42）的Rho家族是许多类型的细胞中调节细胞力学活动的关键调节器，经常介导细胞对生长因子和其他细胞因子的反应[17]。Rho结合并激活Rho激酶可抑制肌球蛋白轻链（Myosin light chain，MLC）磷酸酶，导致MLC磷酸化水平升高和细胞收缩力增加[18]。Rho的激活通常会刺激应力纤维的形成和其与刚性基材的粘连[19]。抑制Rho激酶后，细胞变得更加细长，并且沿随机方向呈扩展树突状生长，细胞迁移速率明显降低[10]。与Rho不同，Rac通常会通过形成较小的局部复合物和肌动蛋白聚合刺激细胞扩散和迁移[10]。Hippo信号通路的2个下游效应子YAP和TAZ的活性，也与机械力的变化有关[20]。当Hippo信号被激活时，这2个转录因子都被LATS1/2磷酸化，然后被隔离在被标记的细胞质中降解。但是，当Hippo信号不活跃时，YAP和TAZ被去磷酸化并转运至细胞核，与TEAD结合并促进下游靶基因的表达[20]。有研究认为YAP/TAZ活性与ECM刚度有关，通过感受下游附着信号的变化，可能涉及Rho途径[20]。

3 相关因素的角膜力学生物学作用

3.1 眼睑和泪膜运动

有研究表明由流体流动引起的剪切应力能够调节角膜上皮和角膜缘细胞的行为[21]。泪膜具有动力学特性，其运动时能够对其下的细胞施加剪切力，施加力的大小受泪膜厚度、成分、粘度和眨眼导致的泪液流动方式调节。体外模拟泪液的流动，研究其对体外细胞的影响，使得我们进一步了解了流体剪切力影响角膜上皮细胞的精确机制。Molladavoodi等[22]研究了流体对黏附在基质上的细胞的影响，发现以4 dyn/cm2的流速施加24 h产生的剪切应力上调了整联蛋白β1 的表达。Hampel等[23]使用IBIDI泵系统复制了在永生化角膜上皮细胞系（Human telomeraseimmortalized corneal epithelial cells，hTCEpi）眨眼期间施加的应力，研究表明施加剪切应力导致更少的细胞间隙，并增加了E-钙粘蛋白、闭合蛋白、桥粒蛋白和紧密连接蛋白的mRNA表达。

3.2 揉眼

揉眼作为一种动态压力外载荷，使角膜法线的方向受压、纵向受拉、表面受剪切力作用，还会引起角膜基质板层之间产生相对滑动，对角膜基质细胞产生剪切作用。高频的揉眼刺激还容易使角膜组织产生动态疲劳，在眼内压作用下由于屈服产生弯曲变形[24]。在揉眼时，会将眼睑推向角膜上皮，从而减少了受压区域下方的泪膜厚度。除压缩外，摩擦过程中的运动还可能导致剪切力作用于角膜上皮。这些力量的结合会对角膜的健康产生负面影响[25]。现有的研究表明揉眼可能是圆锥角膜的重要预测因子，长期非正常揉眼给角膜基质细胞带来力刺激，接受到力信号的细胞可能发生某些生物学行为改变，如细胞形态、增殖凋亡状态、基质合成和降解分子表达情况发生变化，进而促进了圆锥角膜的发病和进展。揉眼会对上皮细胞产生机械刺激，并在揉眼后的1 min内就会引起蛋白酶和炎症标记物（如MMP-13、IL-6和TNF）表达增加进入泪液中[26]。

3.3 扩张性角膜疾病

在扩张性角膜疾病的发生中，力学刺激和炎性因子通过调节细胞外基质的代谢，对角膜成纤维细胞的增殖起到了非常重要的作用。Feng等[27]对体外兔眼角膜成纤维细胞施加不同幅度的力学牵拉，研究力学刺激对角膜成纤维细胞形态的影响，发现力学牵拉使角膜成纤维细胞的F-actin发生收缩，且牵拉幅度越大，F-actin收缩程度越大，使角膜成纤维细胞的迁移受到抑制。短时间、低幅度的力学牵拉能促进 Lumican的表达，高幅度却抑制其表达；低幅度力学牵拉使角膜成纤维细胞 MMP2的表达降低，高幅度力学牵拉使其表达升高；力学牵拉能进一步促进IL-1β引起的MMP2表达的升高[27]。

3.4 角膜屈光手术

角膜屈光手术后角膜基质明显变薄，在相同的眼内压作用下，角膜所受的应力显著增大，角膜基质细胞的力学环境发生变化，从而影响其生长、增殖、凋亡及其分泌的胶原等细胞外基质成分。Feng等[27]的研究表明角膜屈光手术后角膜基质层切削较薄时，角膜成纤维细胞受到的力学牵拉较小，角膜成纤维细胞可通过增加胶原合成、增加lumican的表达、降低MMP2的分泌来进行角膜损伤修复。

3.5 角膜接触镜

有研究发现，配戴角膜接触镜可以减少角膜上皮细胞死亡，这可能是由于角膜接触镜限制了瞬目产生的剪切力作用，瞬目会增加角膜上皮细胞脱落速度和细胞死亡数量[28]。角膜接触镜可以通过限制泪膜在角膜表面的流动来对上皮施加机械作用[29-30]。泪膜的运动引起施加于角膜上皮的剪切力。通过限制角膜接触镜下方的泪液流动，可以抑制这些细胞正常受到的机械刺激。此外，有研究表明配戴角膜接触镜后泪膜的厚度会发生改变，这可能会导致作用于细胞的剪切力大小发生变化[31]。

3.6 眼压变化和青光眼

眼内压的波动可能导致角膜上皮发生变化。随着眼内压的增加，尽管角膜的整体刚度（抵抗变形的能力）不会显著变化，但角膜的形状可能会发生变化，从而会对角膜上皮细胞施加机械应变[25]。Gatzioufas等[32]的研究显示原发性先天性青光眼可以观察到角膜基质细胞密度的降低，但对角膜生物力学例如角膜滞后量（Corneal hysteresis，CH）和角膜阻力因子（Corneal resistance factor，CRF）等没有特定影响。Rossi等[33]的研究显示采用他氟前列素治疗3年的青光眼患者，其角膜基质细胞密度和基质反射率显著降低。

3.7 角膜基质（细胞外基质）的力学特性

细胞与ECM之间的力相互作用会深刻影响基质中角膜基质细胞的行为，尤其是在受伤之后，因为伴随着角膜伤口的修复，修复后组织的刚度通常会发生变化[34]。使用功能化的聚丙烯酰胺（CPdgacrylamide,PA）凝胶已经证明基质刚度的变化可以调节α-SMA在含血清的培养基中的角膜成纤维细胞中的表达[35]。肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）或红海海绵素 B（latrunculin B）可以降低这种刚度依赖性的α-SMA表达[35]。Maruri等[14]的研究显示使用TGF-β1 处理的角膜基质细胞ECM刚度的变化可以调节形态、细胞骨架组织和力产生的亚细胞模式，然而，在没有TGF-β1的情况下培养的角膜基质细胞并没有显示刚度依赖性，这表明仅靠硬的微环境不足以促进角膜基质细胞转化。通过使用一种胶原蛋白底物可以沿单轴机械加载的新型生物反应器，如Zareian等[36]证明了力的各向异性可以诱导远距离细胞和ECM排列，与各向同性底物相比具有更高的稳定性。此外，研究发现细胞的迁移速率也与基材的硬度有关，其在中等硬度和高硬度基材上的迁移速率明显大于柔软基材。通过对细胞骨架结构的研究发现，顺应性好或软的基材上的细胞缺少应力纤维，而在较硬的基材上应力纤维则会增加[37]。紫外线交联可增加角膜基质的硬度，这会引起角膜基质结构和应力分布的改变，从而调节角膜基质细胞反应[38]。

3.8 生物材料设计

研究力学环境对角膜的影响，对辅助生物材料或3D微环境设计并优化细胞所处的化学环境具有很重要的作用。许多生物材料结合了特定的生物成分，例如生长因子和细胞因子，以复制细胞在体生存环境或促进基质沉积[39]。这些生物成分会影响细胞的行为方式以及它们沉积的基质蛋白，进而影响环境的力学性能[40]。随着细胞改变其周围环境的力学性能，新的环境会影响细胞的行为，从而在细胞与环境之间产生动态的相互作用[39]。

3.9 其它

Zhang等[11]通过建立体外细胞机械性压力刺激模型，对人眼角膜成纤维细胞给予不同压力梯度、不同加载时长的机械性压力刺激来观察其对人眼角膜成纤维细胞的细胞形态、增殖与凋亡、基质合成与降解等生命活动中相关分子表达水平的影响。结果显示，人眼角膜成纤维细胞的增殖与凋亡明显会受到机械性压力刺激的影响。机械性压力短时间加载可促进人眼角膜成纤维细胞基质金属蛋白酶家族成员MMP1、MMP9的表达，长时间加载可抑制角膜结构性蛋白Col1a1、Lumican、Vimentin的表达，进而参与影响人角膜基质结构重塑。

刘成星[41]通过对体外培养的兔角膜成纤维细胞进行力学加载，发现周期性牵拉能够促进角膜成纤维细胞增殖，但抑制了细胞迁移行为。EGF和bFGF可以减弱牵拉对细胞迁移的抑制效应。不同幅度周期性牵拉对MMPs、TIMPs和Collagen I表达的调节具有双向性：低幅度牵拉抑制MMP-2表达，对MTl-MMP无显著影响，同时促进TIMPs和Collagen I表达；高幅度牵拉则促进MMP-2和MTl-MMP表达，抑制TIMPs和Collagen I表达[41]。

综上，角膜组织因其复杂性，对不同力学刺激所做出的各种细胞水平、分子等水平响应不同，变化也不尽相同，不仅与刺激的强度相关，也具有时间相关性。研究如何预防并减少力学刺激带来的反应性损伤是需要关注的重要问题之一。此外，由于人眼角膜的珍贵性，建立更好的动物眼模型，更好的模拟人眼角膜也是未来进行角膜力学生物学研究的关键之一。随着对角膜力学生物学研究的不断认识与逐渐深入，最终希冀能够进行临床转化与应用，提高角膜疾病的临床诊断治疗水平。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 薛超：收集查阅分析文献，参与选题，进行文章撰写，根据编辑部的修改意见进行修改。王雁：进行选题，修改论文及技术性指导，文章内容审阅及修改，根据编辑部的修改意见进行修改、审校