液体活检在神经母细胞瘤中的临床研究进展

刘思杨 综述 文飞球 审校

（中国医科大学深圳市儿童医院血液肿瘤科，广东深圳 518000）

神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是儿童最常见的颅外实体瘤，诊断时约50%为高危患者，长期生存率低于40%［1］。NB的诊断、疗效的评估和复发的监测通常是通过肿瘤组织活检，但连续性的侵入性检查不易实施，而且肿瘤组织取样过程中可能导致局部转移。由于NB具有高度异质性，原发性肿瘤及其转移性病变的分子特征并不总是一致的。液体活检在广义上是指以血液为主的体液标本中细胞及核酸的检测，包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）及外泌体等。与传统组织活检相比，液体活检可以大幅缩短癌症确诊时间，对癌症患者的治疗情况进行动态跟踪，真正实现“个性化精准治疗”。本文对液体活检在NB中应用的最新临床研究进展综述如下。

1 CTC

1.1 CTC的概述

CTC是一种肿瘤转移的中间产物，与骨髓（bone marrow，BM）中的播散性肿瘤细胞一起，作为微小残留病（minimal residual disease，MRD）的标志物。MRD指的是缓解期患者在治疗后仍有少量肿瘤细胞存在，是NB患者复发的主要原因［2］。CTC是目前研究最广泛的液体活检标记物，已被广泛用于提供关于原发性肿瘤或转移瘤特征的信息，跟踪肿瘤的动态变化和异质性，并用于检测治疗耐药性和监测复发［3］。CTC在外周血（peripheral blood，PB）中的数量极低，约占PB细胞的百万分之一。因此，对CTC的有效富集与检测是对CTC研究的关键挑战。目前，多种CTC的分离富集方法主要依据CTC的物理特征（大小、密度、电荷等）与免疫学特性。后者采用免疫亲和分离技术，包括以下两种方法：一是通过肿瘤特异性标记物来阳性选择CTCs；二是阴性选择，这种方法是通过去除正常血液成分（包括红细胞、白细胞和血小板），最终富集CTC。微过滤技术的发展使得通过直径大小捕获CTC的灵敏度提高，包括微孔或微流体，还可以专门用于捕获CTC团［4］。除此之外，还有根据肿瘤细胞和血细胞的电荷不同来分离出CTC的介质电泳。富集后的细胞需要进行CTC的识别，主要包括免疫细胞化学法、荧光原位杂交、流式细胞术、逆转录聚合酶链式反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）及酶联免疫斑点实验等。

1.2 CTC在NB的应用情况

Merugu等［5］应用成像流式细胞技术，以GD2+/CD45-作为标记物，对41例NB患者的血浆及BM样本分别进行CTC及播散性肿瘤细胞检测，其中24例有BM浸润的患者中19例在血浆中检测到CTC，没有BM浸润的17例患者中6例检测到CTC，因此CTC的存在或CTC的数量与BM受累相关。重要的是，对19例有BM浸润的新诊断高危NB患者进行一线诱导治疗后，未达到BM完全缓解（complete response，CR）的患者与达到BM CR的患者相比在诊断时血浆中具有更高数量的CTC，因此CTC计数可能有助于评估疗效，以及决定高危NB患者诱导化疗的时间长度，从而指导治疗。同时该研究首次证明了用成像流式细胞技术检测NB患者CTC可以作为早期临床试验中新疗法的非侵入性药效学方面的生物标志物。

Batth等［6］对93例缓解期NB患者进行前瞻性研究，选用细胞表面波形蛋白（cell surface vimentin，CSV）作为PB CTC的筛选标记，在基线（即开始治疗前）和开始治疗后3～4个月的PB样本中均无CSV+CTC的20例患者中，只有1例复发，其余19例无复发，证明了CSV+CTC可以作为判断早期复发（2个月至2年）的重要指标，并且PB无基线CSV+CTC联合BM无MYCN扩增对无复发生存期进行预测的敏感性达到100%。

也有一项随机Ⅲ期试验中，对CTCs进行免疫清除后，高危NB患儿的存活率并未提高［7］。目前NB患者CTC检测所用的标记物及检测技术尚未统一，正在积极探索更为灵敏及准确的检测方法。

2 NB相关mRNA

2.1 检测方法

早期在液体活检中对NB进行基因组鉴定主要依赖于RT-PCR，该方法识别可能由CTC脱落的mRNA。实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）的应用，使NB相关mRNA得以量化，可确定NB细胞与正常细胞之间的临界值。早期研究大多通过单一标志物对NB相关mRNA进行识别，如酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和paired-like homeobox 2B（PHOX2B）。越来越多的研究发现同时对多个NB相关mRNA进行RT-qPCR克服了NB的异质性，从而实现更敏感的MRD检测。除此之外，与RT-qPCR相比，微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是测定特异性核酸丰度更为灵敏的方法，可以提供更准确、更具有可重复性的低水平mRNA检测。

2.2 临床应用

在诊断方面，高危和晚期转移的患者通常PB中具有更高的TH mRNA水平［8］。除了可以作为一种诊断性生物标志物，还有大量研究提出了NB特异性mRNA的预后价值。Viprey等［8］应用RT-qPCR对290例4期NB患儿在诊断时或诱导治疗后BM和PB样本中双皮质素（doublecortin，DCX）、PHOX2B或TH mRNA进行检测，证实了诊断时PB高水平DCX、PHOX2B或TH mRNA与4期NB患儿的不良预后相关。Marachelian等［9］应用RT-qPCR对101例NB患者的BM和PB样本中ACHGA、DCX、DDC、PHOX2B和TH的mRNA进行定量检测，证明了此组标志物在BM和PB中的表达与复发/难治性NB的无进展生存期相关。最新的一项研究结果表明，通过ddPCR测定7种NB相关mRNA（CRMP1、DBH、DDC、GAP43、ISL1、PHOX2B和TH）与高危NB患者肿瘤复发/再生长显著相关，并且证实了在低水平NB相关mRNA的检测方面，ddPCR优于RT-qPCR［10］。

3 ctDNA和cfDNA

血浆中的cfDNA是高度碎片化的DNA，主要来自凋亡细胞，以游离双链DNA片段或核小体的形式存在。肿瘤细胞（包括CTC、原发性或转移性病变的肿瘤细胞）凋亡或坏死时释放到血流中的cfDNA被称为ctDNA。ctDNA可以替代肿瘤活检标本的原因在于具有高特异性和敏感性的准确检测方法，用极少量cfDNA分析单核苷酸变异（singlenucleotide variants，SNVs）和拷贝数改变成为可能。目前主要有两种方法来检测癌症患者血浆样本中的ctDNA［11］。第一种方法主要应用靶向DNA测序技术，如数字PCR、磁珠乳液扩增技术、安全测序系统、深度测序肿瘤个体化建档法和标记扩增子深度测序。其优势在于成本低、耗时短和敏感性高，并且可以评估多重突变，但需要已知突变信息。第二种方法是应用非靶向二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术，如全基因组测序或全外显子测序。

3.1 协助NB的临床诊断

PB中cfDNA水平与肿瘤负荷具有相关性，与健康个体相比，NB患者血浆中cfDNA明显增加［12］。Wang等［13］应用RT-qPCR的方法对79例初诊及79例稳定期的NB患者血浆cfDNA水平分别进行检测，初诊患者血浆总cfDNA浓度中位数是稳定期NB患者的18.6倍，4期患者cfDNA是早期患者的6倍，证实了cfDNA的绝对浓度可以作为NB诊断的生物标志物，并且有助于临床分期。血浆cfDNA总量提供的诊断信息有限，应用NGS技术，配对的肿瘤/正常DNA测序信息可以通过Sequenza软件进行分析，Sequenza软件是一种用于评估cfDNA或原发肿瘤中肿瘤细胞数量的软件包［14］。将ctDNA片段中的肿瘤特异性生物标志物的评估与cfDNA或ctDNA的绝对水平相结合，可以为临床诊断提供更多帮助。

3.2 协助危险分层与指导治疗

Van Roy等［12］应用低深度全基因组测序对37例NB患者PB的ctDNA进行染色体拷贝数分析，其结果与来自原发肿瘤组织活检的微阵列比较基因组杂交结果高度一致。并且该研究还证实了在3、4期转移性肿瘤患者中可以检测到更高数量cfDNA，更易获得cfDNA的拷贝数谱，这在Chicard等［15］的研究中也得到证实。Cimmino等［16］应用识别靶向基因组合的NGS方法，对11例原发性NB患者（其中9例为4期，2例为2期）PB中ctDNA的特异性突变进行识别，其中有9例（81.8%）携带至少1种致病性突变，同时识别出在诊断时未在组织活检中发现的ALK F1174L热点突变，证实了该方法在识别特异性突变方面的潜力，可以为靶向治疗提供依据，从而促进个性化治疗，同时为诊断提供重要依据。

Iehara等［17］应用ddPCR，以NAGK作为参考基因，MYCN和NAGK比值（M/N）作为评价指标，评估43例初次诊断的NB患者血清及肿瘤ctDNA的MYCN基因扩增状态，其灵敏度及特异度均为100%。因此，对于难以获得肿瘤组织标本的患者，可以通过ctDNA检测评估MYCN基因扩增状态，对其危险分层的预测具有重要临床价值。最新的研究应用四重ddPCR方法对ctDNA中的拷贝数变化和热点突变进行评估，该方法具有更高的灵敏度并且成本更低［18］。除了MYCN，其他染色体改变也被认为具有预测不良预后的价值，包括1p缺失（30%）、11q缺失（45%）和17q不平衡增益（60%）［19］，这些染色体畸变也可应用ctDNA进行识别。

3.3 评估治疗反应

ctDNA半衰期短，并且可以检测到比原发肿瘤更多的SNVs，因此克服了NB显著的时间及空间异质性，作为疾病监测的动态生物标志物实时评估治疗反应，以及进行前瞻性的克隆评估。Chicard等［14］用全外显子测序及靶向测序技术对19例NB患者在诊断、治疗前或复发时进行PB的cfDNA检测，发现在CR或部分缓解患者中cfDNA/ctDNA比值明显低于进展期患者，比值分别为33%和67%。说明cfDNA/ctDNA可用于评估治疗反应。同时该研究报道，在复发时发现cfDNA中的17个SNVs在初诊时并未发现，而利用覆盖率更高的靶向测序技术对原发肿瘤进行检测后可以发现这些基因，因此认为这17个突变与不良预后相关［14］。因此通过对PB的cfDNA进行靶向测序可以早期识别具有复发特异性的基因，将有助于监测疾病进展和发展靶向治疗策略。

Kahana-Edwin等［20］应用ddPCR对3名仅应用ALK抑制剂治疗的患者在治疗前及治疗6～8周后检测PB的cfDNA，疾病进展的患者ALK突变增加5倍，对治疗有反应的患者ALK突变均减少，结果表明PB cfDNA中ALK突变可以反映患者对治疗的反应，为实时监测靶向治疗的疗效提供了生物标志物。

3.4 表观遗传学分析

有研究认为，NB的发生发展在很大程度上由表观遗传修饰驱动，因此，有研究通过应用深度测序技术对NB的甲基化状态进行分析来评估治疗反应。Applebaum等［21］应用Nano-hmC-Seal测序技术对34名健康儿童和32名NB患者（27名高风险、2名中风险、3名低风险）在其疾病过程中的不同时间点（诊断、治疗期间和随访）的5-羟甲基胞嘧啶谱进行分析，结果表明NB患儿的cfDNA中5-羟甲基胞嘧啶增加与转移相关，可以作为治疗反应和预后的预测指标，由21例患者组成的验证队列也证实此结论。van Zogchel等［22］应用ddPCR对47例高危NB患者在治疗和随访期间血浆样本的cfDNA中高度甲基化RASSF1A基因进行检测，复发患者在诊断时的高度甲基化RASSF1A绝对水平和相对水平均显著升高，在两个化疗周期后PB高度甲基化RASSF1A与BM mRNA均阳性与不良结局相关，结果表明高度甲基化RASSF1A可以作为检测NB的ctDNA标记物，并且与BM mRNA联合分析可用于监测治疗反应和早期复发，该结论也通过RT-qPCR检测方法得到证实［23］。

在不同肿瘤的不同阶段，ctDNA的侵袭性和代谢程度不同，目前没有固定的标准来评估ctDNA水平，无法保证可靠性及可重复性，因此NB血浆ctDNA的水平和动态变化的检测方法仍需要进一步提高。

4 外泌体

循环外泌体，即参与细胞通信的小泡，直径约40～160 nm，起源于细胞多泡体内的腔内囊泡［24］。在循环中稳定且其内容物不被降解，是细胞通信的动态中介。外泌体的成分包括蛋白质、DNA、信使RNA、microRNA（miRNA）、其他非编码RNA和反映细胞或组织起源的脂质等。外泌体在维持细胞正确的生理状态方面发挥重要作用，并且在病理条件下促进肿瘤的发病、进展和转移［25］。许多类型细胞都可以释放外泌体，包括肿瘤细胞。在病理条件下会有更多的外泌体分泌。外泌体及其成分可以反映亲代肿瘤细胞的特征，并且参与肿瘤的生长与侵袭，是一种有价值的循环生物标记物来源［26］。

4.1 外泌体来源的miRNA——预测化疗反应

miRNA已被广泛描述为不同病理状态的生物标志物。有研究表明，高危NB患者血清样本中特异性miRNA水平与疾病负荷和治疗反应相关［27］。一项研究显示在诱导化疗前后收集52例高危NB患者的血液样本，以CD9作为血浆中总外泌体的标记，以GD2作为NB来源外泌体的标记，结果显示PB中GD2+的外泌体占总外泌体的比例由治疗前的50%下降到27%，这说明高危NB患者的NB细胞来源外泌体在诱导化疗后减少［28］。通过RT-qPCR测量每个PB样本中381个基因的表达，对比发现在治疗前外泌体来源的miRNA（exosomal mircoRNA，exo-miRNA）的数量高于治疗结束后，其中62个exo-miRNAs在治疗后显著下调，表明诱导化疗对exo-miRNAs的表达有显著的抑制作用。同时该研究比较了微小反应（minor response，MR）患者（n=6）和较好部分反应（very good partial response，VGPR）患者（n=8）的exo-miRNAs表达谱，发现3种exo-miRNAs（miR-29c、miR-342-3p和let-7b）在MR患者治疗后显著下调，而在VGPR患者中几乎保持不变，说明这3种exo-miRNAs可以有效区分MR和VGPR患者。除此之外，该研究还提出了化疗耐药指数（即患者体内参与调节的exo-miRNAs的数量除以与特定化疗药物应答相关的exo-miRNAs的总数）与无事件生存具有显著的相关性，因此exo-miRNAs可以作为预测NB化疗反应的循环生物标志物［28］。

4.2 外泌体的蛋白质组学分析——预测PB转移

Colletti等［29］对来自原发肿瘤和转移瘤的NB细胞系的外泌体进行了蛋白质组学比较分析，鉴定出15种蛋白只存在于原发性肿瘤的外泌体中，这些蛋白均参与神经元发育。相反，仅存在于BM转移细胞系的外泌体中的蛋白参与了细胞存活、增殖和癌症进展。这提示外泌体可能是检测NB的PB转移疾病有前景的生物标志物。

4.3 外泌体来源的双链DNA——分析肿瘤体细胞突变

DegliEsposti等［30］通过全外显子测序证明了从NB患者血浆样本中提取的外泌体来源的DNA（exosomal DNA，exo-DNA）代表了原发肿瘤DNA。exo-DNA中检测到的NB癌基因和抑癌基因突变，在原发肿瘤中也检测到；在发病时肿瘤DNA中不存在的体细胞突变被发现存在于exo-DNA中，特别是ALK、ATRX、NF1和TERT基因的变异，这表明exo-DNA可用于分析NB的空间异质性。exo-DNA也可以用于早期识别获得性耐药，如复发患者中的ALK、TP53和RAS/MAPK基因突变。exo-DNA是NB分子诊断和预后评估的1个有潜力的循环生物标志物。为制订个性化化疗方案提供依据，并可用于开发靶向治疗方法。

目前大多数NB外泌体相关研究在细胞系中进行，在患者中进行的研究相对较少。除此之外，在分离富集技术方面，超速离心法仍然是提取exo-DNA的最佳方法，这种方法是非常复杂的，无法实现高通量，目前难以转化为常规临床诊断［31］。

5 结语

液体活检已成为NB诊断研究的新热点。CTC反映肿瘤负荷，可以作为CTC诊断及预后评估的重要工具。ctDNA可追溯NB细胞的异质性，更全面地评估NB的遗传信息以进行更精准的危险分层与预后的评估。外泌体在肿瘤的发生发展中发挥作用并与化疗耐药的发生有关，可以更直观地评估NB患者对化疗的反应，exo-miRNA的检测结果也为优化靶向治疗方案提供参考。因此，这些新型液体活检生物标志物在NB诊断、治疗及预后评估等方面均有临床应用潜力。但目前各种液体活检技术尚不完善，在临床应用液体活检前必须建立标准操作规程并进行大规模前瞻性临床试验进行验证［32］。