circRNA在喉癌中的作用机制及其研究进展

王梅，龚正鹏，于明，梁东

(1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属白云医院 耳鼻咽喉头颈外科，贵州 贵阳 550014)

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一，其中96%～98%为喉鳞状细胞癌。在全球范围内，喉癌的发病率和死亡率分别为2.76/10和1.66/10，严重威胁了人类的健康。虽然近年来对喉癌的研究取得了一定的成果，但其发病机制和病因仍不清楚。目前喉癌的治疗主要以手术治疗为主，放疗、化疗、生物治疗及免疫治疗为辅。尽管采取了多种策略和干预措施，晚期喉癌患者的5年总生存率仍不理想。因此，更好地了解与其进展相关的分子机制对于开发有效的抗喉癌治疗方案至关重要。近年来随着高通量测序技术的出现，越来越多的研究发现circRNA在肿瘤中异常表达，参与肿瘤的发生和发展。本文复习国内外相关文献，就circRNA在喉癌中的可能作用机制综述如下。

1 circRNA的形成

1976年，Sanger等在RNA病毒中首次发现circRNA。circRNA最初被认为是细胞异常剪接的非功能性副产品。随后有研究者发现小鼠睾丸中性别决定区域

Y

基因的circRNA具有可能的功能。接着有研究者在不同物种的真核生物的细胞质中也证实了circRNA的存在。直到2012年，由于高通量测序的进展，大量的circRNA被不断的发现和鉴定。

RNA选择性剪接是真核细胞中一种基本的基因表达事件。前体mRNA由剪接体去除内含子，然后与编码蛋白质的外显子连接，形成成熟的mRNA。与典型的mRNA剪接不同，circRNA是通过反向剪接过程产生的，该过程将下游的5’剪接供体位点与上游的3’剪接受体位点连接起来，形成单链共价闭合环。然后，剪接体移除全部或部分内含子，其余序列连接。按其结构域的不同，circRNA可分为4类：外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA和基因间circRNA。外显子circRNA是最常见的circRNA类型，占已知circRNA的80%以上。目前有3种假说模型来解释外显子circRNA的形成：①套索驱动的环化：供体位点的下游5’剪接位点与受体位点的上游3’剪接位点连接，形成套索结构，继而内含子的内部剪接以形成外显子-内含子circRNA；②内含子配对驱动的环化：供体位点的外显子和受体位点两侧的内含子序列具有相当大的互补性，这使得剪接位点接近形成外显子-内含子circRNA；③RNA结合蛋白介导的环化：RNA结合蛋白通过与侧翼的内含子结合，拉近供体位点和受体位点的距离，从而促进外显子的环化。

2 circRNA的主要生物学功能

结合国内外相关文献，circRNA的主要生物学功能可以概括为以下几点：①微小RNA海绵：circRNA含有miRNA的结合位点，能够以碱基对的方式直接与靶mRNA结合，并触发mRNA的切割或抑制mRNA的翻译，间接调节miRNA下游靶基因的表达。小脑变性相关蛋白1反义RNA(CDR1as)是已经发现能结合miR-7并抑制其生物活性和功能，发挥其分子海绵作用的circRNA。此外，最近的研究表明，单个circRNA可以作为各种miRNAs的海绵，在一定条件下既可以作为肿瘤抑制因子，也可以作为癌基因发挥作用。例如，circHIPK3可以作为miR-558的海绵来抑制膀胱癌中乙酰肝素酶的表达，也可以通过与miR-124-3p相互作用，上调信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)的表达而促进肺癌的发生；②调控亲本基因的表达：有研究表明，有些外显子-内含子circRNA与RNA聚合酶II相互作用，并在转录位点聚集，从而促进其亲本基因的转录。此外，某些circRNA可以与它们的线性对应物竞争，对抗规范的前体mRNA的剪接，从而抑制它们的亲本基因的表达；③蛋白质/肽的翻译：研究发现，许多circRNA具有内部核糖体进入位点或开放阅读框架，参与功能蛋白的转录和翻译。例如，circMb1、circ-SHPRH、circPINT和circ-ZNF609，在内部核糖体进入位点元件的驱动下或被m6A RNA修饰时，都可以作为蛋白质模板。研究报道circ-SHPRH编码蛋白SHPRH-146aa，它作为诱饵保护SHPRH蛋白不被维甲酸调节的核基质相关蛋白(DTL)介导的降解泛素化，从而抑制胶质瘤的发生。此外，由circPINT编码的多肽PINT87aa，直接与RNA聚合酶II相关因子1复合物相互作用，从而抑制转录延长并阻止癌基因

MYC

、

SOX2

、

CPEB1

的表达水平；④蛋白质诱饵：越来越多的证据表明，circRNA充当蛋白质海绵或诱饵来调节基因表达。含有与一种或多种蛋白质的多个互补结合位点的circRNA可能作为蛋白质海绵发挥作用。circRNA和RNA结合蛋白之间的相互作用已被证明影响癌症进展。此外，circRNA还可以作为蛋白质的支架，促进化学反应或阻断蛋白质的功能。例如在小鼠成纤维细胞中，circ-Foxo3可以与周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂p21(p21)和细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cdk2)相互作用，形成三元复合物，从而抑制细胞周期进程。同时，circ-Foxo3还可以作为小鼠双微体2(MDM2)和p53的蛋白支架，诱导p53降解；⑤ 疾病生物标志物：circRNA稳定性高，容易进入体液(全血、血清、血浆、脑脊液、尿液等)，并且其表达模式具有组织、时空和疾病特异性，使得circRNA成为有潜力的疾病生物标志物。

3 circRN的促癌机制

3.1 促进喉癌的增值、转移、侵袭

3.1.1 CDR1as CDR1as是最常作为miR-7海绵研究的circRNA，因此也称为ciRS-7。CDR1as含有70多个miR-7结合位点，可与Argonaute(AGO)蛋白广泛结合。miR-7是一种肿瘤抑制因子，CDR1as通过靶向表皮生长因子受体(EGFR)/RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(RAF1)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号或人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因

PTEN

/胞内磷脂酰肌醇激酶PI3K(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路，在肿瘤发生过程中降低了miR-7的有效性。Zhang等用qRT-PCR检测了60例喉鳞状细胞癌组织和对应癌旁正常组织中CDR1as的表达水平，结果表明CDR1as在喉鳞状细胞癌组织中显著高表达。同时，CDR1as的高表达与TNM分期、肿瘤分化及淋巴结转移密切相关。患者生存时间与CDR1as表达的相关性分析表明CDR1as的表达与喉癌患者的生存率成负相关。此外，miR-7在喉鳞状细胞癌肿瘤组织中表达下调，且CDR1as表达水平与miR-7表达水平呈负相关。在细胞水平上，敲除CDR1as导致了喉鳞状细胞癌细胞系的细胞周期中G1/S期阻滞和凋亡，从而抑制了肿瘤细胞的生长。进一步研究结果显示CDR1as增加了喉鳞状细胞癌细胞中CCNE1和磷酸肌醇-3-激酶催化亚基Δ肽(PIK3CD)的mRNA和蛋白水平，有利于肿瘤的增殖和转移，但肿瘤抑制因子miR-7的表达抑制了CCNE1和PIK3CD在喉鳞状细胞癌细胞中的表达。此外，体内研究的结果表明，CDR1as的单独高表达可以通过促进肿瘤生长和上调肿瘤细胞中与侵袭相关的miR-7靶点CCNE1和PIK3CD，这种作用有助于抵消miR-7的抑癌功能，从而加速了喉鳞状细胞癌肿瘤的生长。简言之，CDR1as是一种促癌基因，通过调节miR-7信号通路促进喉癌的发展。3.1.2 hsa_circ_0023028 hsa_circ_0023028是新发现的一种circRNA，位于基因

C11orf80

的

chr11

:66515849-66590145，在喉鳞状细胞癌组织中明显高表达。此外，喉鳞状细胞癌组织中hsa_circ_0023028的高表达与喉鳞状细胞癌患者的肿瘤分级、淋巴结转移、原发部位、临床分期等临床特征密切相关。miR-194-5p是一种脊椎动物特异性miRNA，在胃癌、喉鳞状细胞癌等人类肿瘤的进展中发挥重要作用。有研究表明，miR-194-5p在喉鳞状细胞癌组织中表达过低，且miR-194-5p的低表达与喉鳞状细胞癌的T分期、临床分期、复发和不良预后相关。有研究报道miR-194-5p的高表达可以通过靶向Wee1抑制喉鳞状细胞癌的恶性表型。Chen等对20例喉鳞状细胞癌实体瘤标本和配对的癌旁非癌组织标本及人喉鳞状细胞癌细胞系(Hep-2和TU212)和正常鼻咽上皮细胞系(NP69)进行qRT-PCR检测，结果发现与癌旁非癌组织相比喉鳞状细胞癌组织中hsa_circ_0023028表达上调，而miR-194-5p在Hep-2和TU212细胞中的表达水平低于NP69细胞。CCK-8和EdU检测结果表明hsa_circ_0023028的下调导致了细胞增殖的显著减少；跨孔迁移和侵袭实验结果显示hsa_circ_0023028的下调抑制了Hep-2和TU212细胞的迁移能力及侵袭能力。进一步研究结果显示miR-194-5p的下调促进了hsa_circ_0023028对喉鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。简言之，hsa_circ_0023028作为miR-194-5p海绵促进喉鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

3.2 抑制喉癌细胞的凋亡

3.2.1 hsa_circ_0000285 Qin等用RT-qPCR检测了50例喉癌组织和喉癌细胞株中hsa_circ_0000285的表达，结果发现喉癌组织中hsa_circ_0000285的表达较癌旁组织高，且喉癌细胞株的hsa_circ_0000285表达也有不同水平的升高。进一步的机制研究发现，敲除hsa_circ_0000285可抑制喉癌中Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路，而

hsa_circ_0000285

基因的过度表达则有相反的作用。hsa_circ_0000285是在鼻咽癌中新发现的一种表达失调的circRNA，并将其作为放射敏感性的预后生物标志物。Wnt/β-catenin信号通路是肿瘤增殖和转移、调节干细胞完整性、干细胞分裂和迁移的重要途径之一，其在转移起始细胞中的表达可能是多种肿瘤发生发展的重要调控因子。例如，通过下调Wnt/β-catenin信号和miR-516b诱导的FZD4表达，circRNA_100290促进结直肠癌的进展。总而言之，

hsa_circ_0000285

作为一种致癌基因，通过诱导Wnt/β-catenin信号通路，通过抑制喉癌细胞凋亡从而促进了喉癌的增殖。3.2.2 circRNA_100290 Wang等发现在喉鳞状细胞癌组织和喉鳞状细胞癌细胞系中circRNA_100290显著上调，且其在喉鳞状细胞癌患者中的高表达水平与TNM晚期和淋巴结转移呈正相关。在细胞培养中，circRNA_100290的上调通过抑制细胞凋亡促进了喉鳞状细胞癌细胞的增殖和集落形成，增强了喉鳞状细胞癌细胞的侵袭或迁移。在体内实验中，circRNA_100290的过表达可以促进喉鳞状细胞癌肿瘤在小鼠体内的生长。小gtp结合蛋白Rap超家族的第5个成员RAP2C是RAS家族成员之一，是多种癌症的致癌基因。例如，RAP2C通过降低基质金属蛋白酶2(MMP2)组织抑制剂的蛋白水平和增加p-Akt的水平，促进人骨肉瘤细胞的侵袭和迁移。进一步的机制研究发现，circRNA_100290作为miR-136-5p的海绵，通过调控靶基因

RAP2C

促进喉鳞状细胞癌的进展。

4 circRNA抑制喉癌的机制

Tian等利用circRNA微阵列对3例喉鳞状细胞癌组织中的circRNA进行测序，发现hsa_circ_0042666是下调的差异基因中表达差异最大的circRNA之一。Wei等通过qRT-PCR检测35例喉鳞状细胞癌组织中hsa_circ_0042666的表达，结果显示，喉鳞状细胞癌组织中hsa_circ_0042666表达明显降低，且hsa_circ_0042666的低表达与晚期喉鳞状细胞癌患者的肿瘤分期、淋巴结转移及预后不良有关。体外功能检测结果显示，hsa_circ_0042666可降低喉鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭能力。进一步研究表明，hsa_circ_0042666在喉鳞状细胞癌中充当miR-223的海绵。有研究报道转化生长因子(TGF)-β-III型受体(TGFBR3)在癌症进展中起关键作用。例如, Li等发现miR-19a/miR-424通过调控TGFBR3表达促进舌癌的发生发展。在这组学者的研究中，TGFBR3作为为喉鳞状细胞癌中miR-223的靶点，且敲除TGFBR3后增强了喉鳞状细胞癌细胞的侵袭能力。简言之，下调的hsa_circ_0042666通过调控miR-223/TGFBR3轴，在喉鳞状细胞癌中发挥抑癌作用。

目前circRNA在喉癌中的可能作用机制研究并不是太多，近几年喉癌中异常表达的circRNA主要研究情况见表1。

表1 喉癌中异常表达的circRNAs

circRNA表达情况作用机制与喉癌的关系hsa_circ:chr20:31876585-31,897,648下调可能主要调控PPAR轴突导向、Wnt和细胞周期信号通路[44]肿瘤抑制剂hsa_circ_0042666下调作为miR-223的海绵,竞争性与miR-223结合,调控TGFBR3基因[42]抑制喉癌的增殖和侵袭hsa_circ_0044520和hsa_circ_00445229上调竞争性抑制hsa-miR-4726-5p和hsa-miR-4640-5p的活性,调控COL1A1基因参与胶原的合成[45]促进喉癌的发生发展CDR1as(ciRS-7)上调作为miR-7的海绵,竞争性抑制miR-7的活性,增加CCNE1和PIK3CD的表达[31]促进喉癌的增殖和转移has_circ_0023028上调作为肿瘤抑制剂miR-194-5p的海绵,竞争性抑制了miR-194-5p的活性,调控Weel基因[35]促进喉癌的增殖、迁移和侵袭circRNA_100290上调作为miR-136-5p的海绵,竞争性抑制miR-136-5p的活性,促进癌基因RAP2C的表达[39]促进喉癌的增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡circMYLK上调作为肿瘤抑制因子miR-195的海绵,竞争性抑制miR-195的活性,增加cyclinD1的表达[46]促进喉鳞状细胞癌的增殖和细胞周期的进展circFLNA上调充当miR-486-3p的海绵,竞争性与miR-486-3p结合,增加移行标志MMP2和FLNA蛋白的表达[47]促进喉鳞状细胞癌细胞的迁移circRASSF2上调充当miR-302b-3p的海绵,竞争性抑制miR-302b-3p的活性,促进癌基因IGF-1R的表达[41]促进喉癌的增殖、转移和侵袭,抑制细胞的凋亡circ-CCND1上调与HuR和miR-646相互作用,从转录后水平调控CCND1基因,进而增强CCND1的稳定性[48]促进喉癌的增殖has_circ_0057481上调充当miR-200c的海绵,竞争性抑制miR-200c的活性,调控ZEB1的表达[49]促进喉癌的增殖和转移hsa_circ_0000285上调激活Wnt/β-catenin信号通路[36]促进喉癌的增殖和抑制细胞凋亡hsa_circRNA_100855上调未知促进喉癌的增殖和转移[32]hsa_circRNA_104912下调未知抑制喉癌的增殖和转移[32]circCORO1C上调竞争性结合let-7c-5p,阻止其降低PBX3水平,促进上皮-间充质转化[50]促进喉癌的增殖、转移circPARD3上调海绵细胞化miR-145-59激活PRKCI-Akt-mTOR通路[51]促进喉癌的增殖、转移及化疗耐药

注：PPAR：过氧化物酶体增殖物激活受体；TGFBR3：转化生长因子β-III型受体；COL1A1：胶原蛋白I型Alpha1链；PIK3CD：磷酸肌醇-3-激酶催化亚基Δ肽；cyclin D1：G1/S-特异性周期蛋白-D1；MMP2：蛋白基质金属蛋白酶2；FLNA：细丝蛋白A；IGF-1R：胰岛素样生长因子1受体；CCND1：周期蛋白D1；PBX3：同源盒基因3；PRKCI：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶蛋白激酶c；Akt：蛋白激酶B；mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

5 总结与展望

综上所述，circRNA在喉癌的相关研究较少，但就目前的研究显示其在喉癌中的发生发展中也发挥重要的作用，参与了喉癌的侵袭、增值、凋亡、转移，可作为喉癌的早期诊断及预后的标志物。相信随着生物信息学的发展及人们对基因组学研究的进一步深入，circRNA 在基因水平上与喉癌的相关性终将明晰，届时circRNA将成为喉癌治疗的新靶点，为喉癌患者的早期诊断和评估预后提供生物学标志物。