NLRP3炎症小体信号通路在糖尿病角膜病变发生和发展中的作用

万鲁芹 周庆军 综述 谢立信 审校

1山东第一医科大学附属眼科研究所 山东第一医科大学附属青岛眼科医院，青岛 266071；2山东第一医科大学附属眼科研究所 山东省眼科学重点实验室一省部共建国家重点实验室培育基地，青岛 266071

糖尿病是多病因引起的以高血糖为特征的慢性疾病，其发病率逐渐升高。预测到2045年全球成人糖尿病患者总数将达到6.29亿。长期高血糖可导致糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病角膜病变(diabetic keratopathy，DK)等眼科并发症的发生，对视力及视功能造成严重影响。60%～70%的糖尿病患者会发生DK，DK通常没有症状，但在眼外伤或手术后出现角膜上皮愈合延迟等表现，给临床医生带来极大的挑战。目前DK的发病机制尚不完全明确，可能与异常炎症、氧化应激及神经损伤等有关。研究发现抗炎治疗可改善DK患者的角膜上皮延迟愈合及促进神经修复。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体作为机体固有免疫反应组成部分可能在DK的发展中起促进作用。NLRP3炎症小体活化后参与炎症反应，但活化失调会导致神经退行性疾病、2型糖尿病等发生，并参与糖尿病慢性并发症的发展，其持续激活可引发慢性炎症导致糖尿病患者伤口延迟愈合。NLRP3炎症小体信号通路相关因子在DK中已有涉及，本文针对其与DK的研究现状及前景进行综述，以期为进一步研究DK的机制和治疗提供方向。

1 DK的临床特征和发病机制

DK临床发病相对隐匿，多伴发角膜知觉减退、糖尿病性干眼、角膜细胞外基质成分及角膜形态结构改变，其中形态结构改变包括上皮细胞数量减少、增生变慢，黏附性降低；晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)在上皮基底膜和内皮细胞蓄积；内皮细胞形态异常及基底神经丛密度降低等。当角膜受到外伤或内眼手术刺激后会出现明显角膜病变，包括角膜上皮延迟愈合、点状角膜炎、角膜溃疡形成等，严重者可继发角膜感染。目前DK的发病机制涉及高糖环境下基因表达异常、异常炎症、异常代谢产物蓄积、氧化应激及角膜神经损害等过程，但具体机制尚未明确。多种机制之间存在相关性，异常代谢产物蓄积会诱发氧化应激及异常炎症，而角膜神经损伤会导致角膜营养障碍，加重氧化应激，异常炎症会导致角膜上皮延迟愈合及神经损伤。DK的发病机制是多因素相互作用的结果，哪种致病因素起主导作用尚待深入研究。

2 NLRP3炎症小体信号通路与DK

NLRP3炎症小体是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1前体组成的一类多蛋白复合体。在受到细胞内特定信号刺激时，NLRP3发生寡聚化，促使有活性的白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18释放，参与下游炎症反应。在正常生理情况下，NLRP3炎症小体有感知代谢紊乱、监督识别病原体的积极作用；在急性炎症反应期其可参与炎症反应，活化固有免疫反应；在慢性炎症反应时，NLRP3炎症小体过度活化引起细胞炎性坏死。NLRP3炎症小体经典活化途径通常需启动和激活2种信号。启动信号是由核转录因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)介导的NLRP3和细胞因子前体转录水平上调，激活信号包括外源病原相关分子模式和内源危险相关分子模式、外源三磷酸腺苷(ATP)激活细胞表面嘌呤能受体P2X7介导的细胞内K外流、细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增多、溶酶体破裂等。生理状态下线粒体自噬可通过吞噬NLRP3炎症小体、降解IL-1β和IL-18前体等发挥负调节作用。NLRP3炎症小体已被证实参与多种眼科疾病的发生和发展；其信号通路相关因子参与糖尿病创伤延迟愈合、介导周围神经病变、促进异常炎症反应、感受氧化应激及异常代谢等，可能参与DK的发生和发展。

2.1 NLRP3炎症小体与糖尿病角膜上皮延迟愈合

炎症小体参与先天免疫反应，对于正常皮肤伤口愈合过程至关重要。

NLRP3

基因敲除小鼠的皮肤伤口愈合较野生型慢，提示适度的炎症反应参与正常的伤口修复。而持续的炎症会延迟伤口愈合。慢性低度炎症和持久性氧化应激状态被认为是糖尿病并发症发展的2个主要致病因素。研究发现，NLRP3炎症小体作为代谢应激的传感器参与糖尿病并发症的发展，与NLRP3炎症小体相关的IL-1β、ROS等均参与糖尿病的发病机制。在糖尿病发生期间，损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)的积累持续激活NLRP3炎症小体，引发持续炎症及糖尿病创伤的延迟愈合。糖尿病创面愈合的晚期，局部巨噬细胞以促炎症的M1型为主，可上调NLRP3炎症小体的表达，导致糖尿病相关的人和小鼠伤口愈合受损。因此NLRP3炎症小体被认为在糖尿病伤口的持续炎症中起关键作用，抑制其表达可缩短糖尿病皮肤伤口愈合时间。中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)通过NF-κB信号传导途径诱导NLRP3活化，上调pro-IL-1β水平，导致糖尿病小鼠皮肤伤口慢性炎症的持续存在，影响伤口愈合。P2X7受体-NLRP3炎症小体-IL-1β通路在糖尿病皮肤伤口中高表达，上游及下游分子被阻断均可改善伤口愈合。二甲双胍通过调节AMPK/NLRP3炎症小体信号轴、抑制NLRP3炎症小体活性和诱导促修复的M2型巨噬细胞极化来改善糖尿病伤口愈合。

角膜上皮愈合延迟是DK的典型表现之一，与糖尿病皮肤伤口延迟愈合有相似之处。炎症反应对角膜上皮创伤后的修复有积极意义，异常炎症反应则抑制伤口愈合。对角膜上皮碱烧伤模型的研究显示，无菌角膜损伤后释放的DAMPs激活NLRP3及下游炎性因子，阻断NLRP3途径可以抑制炎症并改善角膜清晰度。DK作为糖尿病眼部并发症之一，NF-κB、Ml型巨噬细胞和AGEs等诱导的异常炎症可参与角膜上皮的延迟愈合。NF-κB被认为是炎症和凋亡相关疾病的启动机制。高糖环境可激活人角膜上皮细胞中NF-κB信号通路以及IL-1β的表达，加重糖尿病患者角膜组织的炎症反应；在糖尿病大鼠角膜组织中NF-κB高表达。研究发现在DK小鼠角膜组织中巨噬细胞功能异常，角膜上皮损伤后致炎症M1型巨噬细胞比例升高，促修复的M2型巨噬细胞比例降低；促进M2型巨噬细胞转化可促进糖尿病小鼠角膜上皮愈合。AGEs可以激活人髓核细胞中NLRP3炎症小体，促进胰岛及血管内皮细胞损伤、诱发炎症性疾病。AGEs在糖尿病大鼠角膜上皮和内皮组织中的表达升高，可能参与糖尿病创面愈合延迟。

NLRP3炎症小体与NF-κB、Ml型巨噬细胞和AGEs关系密切。NF-κB与M1型巨噬细胞均可上调NLRP3炎症小体的表达；AGEs作为内源性和无菌危险信号可激活NLRP3炎症小体活化，促进炎症反应。抑制NLRP3炎症小体激活可以促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，AGEs通过激活NF-κB通路促进巨噬细胞向M1型方向极化。在糖尿病肾脏组织中，AGEs、NF-κB、NLRP3、caspase-1、IL-18及IL-1β表达均增加，吡格列酮可通过抑制NLRP3炎症小体的激活来改善糖尿病肾病的组织损害。此外，糖尿病创面自噬水平增高，过强自噬不利于创面愈合，而自噬体可通过吞噬NLRP3炎症小体、清除功能异常的线粒体等负性调控NLRP3炎症小体活化。Minns等研究发现，糖尿病患者、大鼠和小鼠角膜中ATP激活的P2X7受体增加，这可能与上皮组织延迟愈合相关。而P2X7受体在糖尿病皮肤伤口中高表达，可激活NLRP3炎症小体导致伤口延迟愈合。NLRP3炎症小体参与糖尿病皮肤创伤的延迟愈合，且与之通路相关的NF-κB、M型巨噬细胞、AGEs、IL-1β等诱导的异常炎症可参与糖尿病并发症的发生及角膜上皮的延迟愈合。基于以上研究可以推测NLRP3炎症小体介导的炎症反应可能参与了DK角膜上皮延迟愈合的发生。最新研究结果发现，NLRP3炎症小体在糖尿病角膜上皮损伤修复中处于持续活化状态，抑制其活化后可促进角膜上皮的损伤修复，且NLRP3炎症小体参与正常角膜上皮的损伤修复。但NLRP3炎症小体是否介导DK中巨噬细胞极化、自噬作为NLRP3炎症小体的负调节机制是否参与角膜上皮创面愈合的调控等方面尚待进一步研究。

2.2 NLRP3炎症小体与糖尿病角膜神经病变

糖尿病角膜神经病变是糖尿病周围神经病变的一部分。角膜神经属于三叉神经在角膜组织的终末分支，发挥神经营养作用。研究发现糖尿病大鼠模型中角膜神经纤维分支少且细短，再生能力下降。角膜神经损伤可导致角膜上皮延迟愈合、神经营养性溃疡等症状，是导致DK的原因之一。中性粒细胞与淋巴细胞比值、糖尿病病程等被认为是糖尿病周围神经病变的独立危险因素，随着年龄和病程增加，中性粒细胞水平相应增加，引起全身炎性因子水平升高，进而导致神经组织缺血、缺氧及变性。

NLRP3炎症小体介导的炎症反应参与中枢及周围神经病变，导致神经疼痛，抑制NLRP3炎症小体后可改善神经疼痛症状。在脊髓慢性压迫性损伤小鼠模型中，miR-34c可通过直接结合3'-非翻译区来抑制NLRP3的表达，通过抑制NLRP3介导的神经炎症来延缓神经病理性疼痛的发展。在坐骨神经结扎建立的坐骨神经损伤模型中，硫氧还蛋白结合蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)-NLRP3炎症小体轴介导神经病理性疼痛，miR-23a可通过抑制脊髓神经胶质细胞中趋化因子CXC受体4(CXCR4)，减少NLRP3炎症小体的表达来缓解神经疼痛。在小鼠坐骨神经慢性压迫性损伤中，NLRP3和NF-κB-p65等通路被上调，参与慢性神经炎症和神经坏死。此外，脊髓星形胶质细胞中的连接蛋白43(connexin43，Cx43)半通道参与周围神经损伤后的神经性疼痛，通过多肽5阻断Cx43半通道可下调NLRP3炎症小体，减轻神经疼痛。对糖尿病神经病变体外模型进行研究发现，NF-κB信号通路表达增加会加速神经元凋亡，引发糖尿病周围神经的异常疼痛，抑制NF-κB表达后，可降低炎性细胞因子，改善疼痛症状。

NLRP3炎症小体参与周围神经损伤与神经疼痛涉及的TXNIP-NLRP3、Cx43-ATP-NLRP3和NF-κB-NLRP3通路。研究发现，ROS表达增加、Cx43半通道介导的ATP释放和NF-κB活化等均可激活NLRP3炎症小体，参与视网膜色素上皮细胞、神经细胞的损伤。糖尿病周围神经病变与DR存在一定的相关性，且具有共同的致病危险因素。与非糖尿病周围神经病变相比，糖尿病周围神经病变患者发生DR和晚期DR的风险增加。

目前尚无NLRP3炎症小体在糖尿病角膜神经病变中的直接相关研究，但NLRP3炎症小体介导的炎症反应参与中枢及周围神经病变，且在糖尿病神经并发症的发生和发展中起作用。糖尿病患者角膜神经支配的病理改变是糖尿病神经病变的重要早期指标，角膜敏感性降低与糖尿病持续时间以及神经病变的严重程度密切相关。在DK中抗炎药物及神经生长因子治疗可改善炎症反应，促进神经纤维再生，提示炎症因素在角膜神经病变中起到一定的作用，可以推测NLRP3炎症小体相关通路参与了糖尿病角膜神经病变的病理生理过程。Wan等研究发现，NLRP3炎症小体的抑制剂MCC950可以促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤后神经敏感度的恢复，并促进上皮下神经的修复，但该研究未对角膜神经类型进行深入研究。未来可从NLRP3炎症小体相关通路着手，开展糖尿病角膜神经病变的基础研究。

2.3 NLRP3炎症小体与糖尿病角膜氧化应激

氧化应激是引起DK的重要机制之一，指体内氧化过度导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，是导致衰老和疾病的重要因素之一。高糖状态下葡萄糖可以转化为脱氧葡萄糖酮醛，同时伴随自身氧化，产生大量ROS，直接氧化和损伤细胞DNA，造成细胞凋亡。ROS同时也参与糖尿病伤口延迟愈合以及糖尿病小鼠周围神经病变的发生和发展。

糖尿病中单核细胞和血管内皮细胞中增加的ROS可诱导NETs的形成和释放，进而激活NLRP3炎症小体，促进IL-1β的释放。此外ROS增加RAGE的表达来激活NF-κB，启动炎症小体活化信号。ROS刺激细胞内Ca升高，启动NLRP3炎症小体的激活信号来促进NLRP3炎症小体活化。在高糖培养的人角膜上皮细胞中ROS及IL-1β表达增加，同时伴有AGE的累积与NF-κB信号通路的激活。AGEs导致细胞功能受损，产生氧化应激，上调细胞内的ROS水平，而ROS能加速AGEs的形成，两者之间形成恶性循环，参与DK的发病。氧化应激可导致糖尿病角膜上皮延迟愈合，与ROS激活NLRP3炎症小体导致异常炎症及神经损伤相关。转录因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid factor 2-related factor 2，Nrf2)是一种抑制氧化应激及炎症反应的转录因子，在糖尿病中受损。Nrf2介导抗氧化防御的激活可改善小鼠糖尿病皮肤伤口愈合，说明Nrf2在机体氧化应激过程中起保护作用。研究发现Nrf2-NLRP3炎症小体通路参与DR的发展，Nrf2激活后可清除NLRP3炎症小体的激活剂ROS，下调NLRP3炎症小体的表达及炎性因子的活化，延缓DR进展。此外，通过抑制与ROS相关的TXNIP表达，降低炎症小体的活化，可以减轻视网膜神经细胞的损伤。由此可以推测ROS可能通过激活NLRP3炎症小体介导了DK的角膜上皮延迟愈合与神经损伤。

此外，还有研究发现自噬可以调节ROS和NLRP3炎症小体，高葡萄糖诱导的自噬缺乏会增加ROS的产生，进而激活NLRP3炎症小体，导致下游因子IL-1β分泌。抗氧化治疗、自噬、ROS产生和NLRP3炎症小体激活之间的联系表明氧化应激介导的炎症参与糖尿病伤口愈合延迟。以上结果为研究NLRP3炎症小体在糖尿病角膜上皮延迟愈合及神经病变中的作用提供了参考方向。

3 结语和展望

综上所述，NLRP3炎症小体的激活是糖尿病伤口延迟愈合及周围神经病变的重要影响因素。糖尿病慢性并发症中NLRP3炎症小体激活的主要机制包括AGEs、NF-κB、ROS-TXNIP、ATP-P2X7受体等。DK作为糖尿病慢性并发症之一，主要与高糖环境下周围神经异常、氧化应激、异常炎症等相关。有关DK的研究多集中在角膜上皮损伤延迟愈合、神经敏感性下降和糖尿病性干眼的机制和治疗，对于三者之间的内在联系及发病机制研究尚少。目前为止，NLRP3炎症小体与DK之间的研究仅限于通路相关因子的研究，其对糖尿病角膜上皮延迟愈合、糖尿病角膜神经病变的直接作用研究尚处于初步开展阶段。已有NLRP3炎症小体在DR、DK、糖尿病创伤愈合、糖尿病周围神经病变、干眼等疾病作用机制的研究，并且针对NLRP3炎症小体相关通路的调控药物、抑制剂、自噬增强剂等已在临床或动物实验中证实有效，为深入研究NLRP3炎症小体信号通路在DK中的作用机制提供了理论依据。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突