榆耳、桑黄天然复合防腐剂的研制

穆淑媛 庞献伟 李冬梅 韩秀

（泰安市泰山林业科学研究院 山东泰安 271000）

关键字 榆耳；桑黄；天然复合防腐剂；抑菌

1 前言

榆耳、桑黄均为名贵食、药用菌，在我国具有较长的入药历史。榆耳（Gloeostereum incamatum），学名肉红胶韧革菌，民间常用榆耳水煎液治疗肠炎、痢疾、腹泻[1]等疾病；桑黄（Sanghuangporus sanghuang）的药用价值最早记载于李时珍的《本草纲目》中，是国际认同的抗肿瘤效果较好的一种药用真菌[2]。除了常见报道的抗肿瘤、抗炎症、抗氧化作用外，其抑菌活性也逐渐被关注。有研究[3-6]表明，榆耳、桑黄的单一提取物或发酵液对痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌等具有明显的抑制作用。但对于榆耳和桑黄复合提取物的抑菌效果未见报道。

天然防腐剂具有安全无毒、抗菌效果好、作用范围广等化学防腐剂不可比拟的优点，正逐步替代化学类防腐剂，市场前景广阔[7]。目前对动物源、植物源和微生物源的天然防腐剂报道比较多，对食用菌源的研究较少。

单一的天然防腐剂抑菌谱窄、抑菌能力有局限性、使用量大，多种天然防腐剂适当复配，不仅能降低防腐剂的使用量，还能明显拓宽抑菌谱、提高抑菌效果[8]。因此本研究将榆耳、桑黄子实体提取物复配并研究其抑菌性，旨在为开发一种用于食品防腐的天然复合防腐剂做部分基础工作。

2 材料与方法

2.1 试验材料

榆耳、桑黄子（泰安市泰山林业科学研究院）；大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium candidum）（山东农业大学植保学院）；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（上海保藏生物技术中心）；PDA培养基、肉汤培养基（实验室配制）。

2.2 试验方法

2.2.1 榆耳水提液制备

将榆耳子实体在60℃条件下烘干称重，加入30倍去离子水；浸泡24 h，沸水提取2 h；经4层纱布过滤，对滤出的残渣进行二次提取；合并2次滤液，减压过滤并浓缩蒸干，即为榆耳水提物。水提物加入无菌水，分别配置成浓度为1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL的水提液，备用。

2.2.2 桑黄水提液制备

将桑黄子实体在60℃条件下烘干，粉碎至0.5 cm3以下颗粒状，称重；加入30倍去离子水，沸水提取2 h；之后处理同2.2.1。

2.2.3 细菌抑制试验

结合双层平板法及杯碟法进行测定[9]。将细菌活化，之后接种于液体肉汤培养基；37℃条件下振荡培养16 h，调节菌液浓度至106cfu/mL，备用；将下层培养基倒入平板内，待其凝固后，取1 mL菌液混入；置于9 mL培养基中，冷却至约45℃；立即倾倒覆盖于下层培养基上，使其均匀摊布；迅速对称放置无菌牛津杯（外径7.8 mm），待上层带菌培养基冷却后，向牛津杯中加入水提液（100 μL/孔）；使用无菌水作对照，37℃条件下培养24 h，测量抑菌圈直径。

2.2.4 霉菌抑制试验

将无菌水提物均匀混入PDA培养基，使其浓度为1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL，并倾倒在平板上；待其凝固后，在平板中心接种直径为0.5 cm的青霉菌块；30℃培养5 d，测量菌落直径。

2.2.5 天然复合防腐剂最小抑菌浓度（MIC）的测定

参照张亚楠[10]的研究，并稍作改动。选取榆耳、桑黄水提液最佳抑菌浓度，配制天然复合防腐剂。用无菌水将复合防腐剂梯度稀释，使复合防腐剂的体积分别占总体积的0%、5%、10%、15%、20%、25%、50%、80%、100%。在对应的平板培养基中，分别加入不同浓度的复合防腐剂100 μL，再加入浓度为106cfu/mL的菌液或孢子悬浮液100 μL，涂布均匀；稍干后，置于适宜温度的恒温培养箱内进行培养（细菌30℃培养24 h；霉菌30℃培养3 d）。通过测定其对不同腐败菌的抑制效果，确定天然复合防腐剂的最小抑菌浓度（MIC）。

3 结果与分析

3.1 对细菌的抑制效果

抑菌圈的直径大小能够表示水提液的抑菌能力，其直径越大，表明其抑菌能力越强。从表1可以看出，榆耳和桑黄水提液的抑菌能力均随水提液浓度的升高而增强，整体对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌能力稍强于阴性菌大肠杆菌；在相同的水提液浓度下，桑黄对细菌的抑制能力略强于榆耳，在水提液浓度为1 mg/mL时，桑黄即对2种细菌表现出抑制能力；当水提液浓度为20～50 mg/mL时，2种水提液均有较好的抑菌效果。考虑到成本因素，可选择2种水提液浓度为均为20 mg/mL。

表1 榆耳、桑黄2种水提液对细菌的抑制效果

3.2 对霉菌的抑制效果

从表2可以看出，在桑黄水提物的作用下，青霉的生长速度随作用浓度的升高而不断降低，而榆耳水提物对青霉的抑制效果不明显。在10 mg/mL、50 mg/mL时，桑黄水提物对青霉的抑制效果分别达到45%和76%。

表2 榆耳、桑黄2种水提液霉菌的抑制效果

3.3 榆耳、桑黄天然复合防腐剂的MIC

按照榆耳水提物20 mg/mL、桑黄水提物20 mg/mL配制天然复合防腐剂。通过测定对不同腐败菌的抑制效果，确定天然复合防腐剂的MIC。结果表明，复合防腐剂对细菌、青霉均有明显的抑制效果，能够显著扩大抑菌谱，且对细菌的抑制作用明显优于霉菌，见表3。

食用菌腐败初期一般都是以细菌侵害为主，因此，本文以完全不长细菌的浓度作为该天然复合防腐剂的最小抑菌浓度。从表3可知，当复合防腐剂的浓度在20%时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均不生长，大肠杆菌零星生长；当浓度达到25%时，3种细菌均不生长，因此榆耳、桑黄天然复合防腐剂的MIC为25%，此时，其对细菌完全抑制，霉菌受明显抑制，表明其抑菌活性良好。

表3 榆耳、桑黄天然复合防腐剂的MIC

4 结论

榆耳、桑黄天然复合防腐剂最佳配比为：榆耳水提物20mg/mL、桑黄水提物20mg/mL；以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种细菌为指示菌，测得复合防腐剂最小抑菌浓度为25%。本文研究的榆耳、桑黄天然复合防腐剂，对细菌、霉菌均有明显的抑制效果，且对细菌的抑制作用明显优于霉菌，具有抑菌谱较广的优点，可在实际工作中应用。