双通道放电低温等离子体灭活螺旋鱼腥藻研究

蒲思川，边 娜，刘 钊，贺 佳，师兰婷

(1.西安工程大学 环境与化学工程学院，陕西 西安 710048；2.西安石油大学 陕西省油气田环境污染控制技术与储层保护重点实验室，陕西 西安 710065；3.西安电力高等专科学校 能源与动力工程系，陕西 西安 710032)

0 引 言

近年来，随着我国人口的增长和工业化进程的加速，大量氮、磷等有机营养物质排入水体，造成水体严重富营养化，蓝藻水华频繁爆发[1]，成为我国湖泊、河流污染治理的难题之一，亟需寻求安全、有效的蓝藻水华控制技术来解决这一问题。

目前，国内外治理蓝藻水华的方法有化学法、生物法和物理法等。采用化学方法在湖泊中投放杀藻剂[2]和金属盐[3]，虽然比较快速、高效，但无法彻底根除[4]，还会使部分藻类的藻毒素释放到水中威胁水质安全[5]，杀藻剂本身也容易造成水体的二次污染[6]，通常只能作为应急措施。生物法利用生态系统中的食物链原理和生物之间的相生相克关系来控制藻类生长[7]，虽然不存在化学污染问题，是一种“绿色”的除藻方法，但在湖泊大量投放食藻动物，有可能对湖泊生物种群结构、生物多样性造成一定的影响。且微生物的培养驯化对技术和管理要求都很高，作用时间长[8]，并需要投入大量的资金[9]。物理方法中的机械清除[10]、直接过滤[11]、超声[12]、气浮[13]和混凝沉淀[14]等方法，能直接清除湖面蓝藻水华，且无明显负面影响，但存在对高藻水的除藻效果不理想，受场地限制难于进行规模化运行[15]，能耗大[16]，实施难度也大[17]等问题。综上所述，虽然人们在蓝藻治理方面进行了不少研究，但现有的蓝藻处理方法存在二次污染[18]，蓝藻藻毒素释放到水体中影响水质安全[19]，处理效率不高，不能从根本上消除蓝藻水华，容易反弹[20]。

低温等离子体(Low-temperature/Cold plasma)，又称非平衡态等离子体，主要是由气体放电产生的，内部电子温度在104K以上，而原子、分子及离子等重粒子的温度却非常接近常温(300～500 K)[21]，从而形成热力学上的非平衡态。低温等离子体的非平衡性使得电子有足够的能量激发、电离和离解反应物，可以进行热力学上不易发生的化学反应。低温等离子体主要有电晕放电、介质阻挡放电、常压辉光放电、次辉光放电、微波放电等几种产生方式[22]。目前，低温等离子体应用广泛，包括刻蚀[23]、薄膜沉积[24]、聚合膜改性[25]，对废气、废水的处理[26-27]，各种材料的表面处理[28-29]，O3制备[30]，灭菌消毒[31]、等离子体显示[32]、农业育种[33]等。低温等离子体技术具有清洁、高效、无选择性，能在常温下实现普通化学实验室里难以实现的化学反应，且无二次污染[34]的特点。

目前，低温等离子体技术在除藻方面已有一些研究和应用。李俊楠等利用同轴型三电极介质阻挡放电反应器对铜绿微囊藻进行抑制效应研究[35]。MIZUKOSHI等利用高压脉冲放电等离子体处理硅藻和钙球藻，发现低温等离子体对藻细胞结构以及细胞内容物具有破坏作用[36]。MARLEK等利用低温等离子体技术结合水力空化技术去除自来水厂预处理前原水中的蓝藻，去除效果好，且无微囊藻毒素产生，不会造成二次污染[37]。宋丹利用平板式介质阻挡放电反应器对小球藻进行了杀灭试验，放电处理10 min，小球藻灭活率达到100%[38]。

在蓝藻水华中，螺旋鱼腥藻是爆发最多的优势藻种之一[39]。鱼腥藻可产生毒素，对环境和人畜健康造成极大危害[40]。本文以螺旋鱼腥藻为研究对象，采用双通道放电低温等离子体反应器对螺旋鱼腥藻进行灭活研究，并检测其灭活效果，分析其作用机理，以期为蓝藻水华治理提供理论依据和数据支持。

1 实 验

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

硼酸、氯化锰、柠檬酸、硫酸锌(AR，天津市博迪化工有限公司)；盐酸、磷酸、无水乙醇(AR，西安三浦精细化工有限公司)；乙二胺四乙酸二钠、碳酸钠(AR，天津市登峰化学试剂厂)；氢氧化钠、磷酸氢二钾(AR，天津市河东区红岩试剂厂)；柠檬酸铁铵、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(AR，天津市科密欧化学试剂有限公司)；钼酸钠(AR，天津市化学试剂四厂)；氯化钠(AR，天津市化学试剂六厂)；硝酸钴(AR，西安门捷科技有限责任公司)；硫酸镁(AR，天津市巴斯夫化工有限公司)；无水硝酸钠(AR，成都金山化学试剂有限公司)；硫酸铜(AR，天津市恒兴化学试剂有限责任公司)；硫代巴比妥酸(AR，上海楷洋生物技术有限公司)。实验用水均为去离子水。

1.1.2 仪器

台式离心机(TGL-16C，上海安亭科学仪器厂)；电导率测试仪(EC215，意大利哈纳公司)；智能型智能光照培养箱(GXZ，宁波江南仪器厂)；台式酸度测定仪(pH213，意大利哈纳公司)；紫外可见分光光度计(Agilent8453，安捷伦科技有限公司)；全自动压力灭菌消毒器(LDZX-40II，上海申安医疗器械厂)。

1.1.3 藻种

螺旋鱼腥藻(购自中科院武汉水生生物研究所国家淡水藻种库，FACHB)。

1.1.4 实验装置

采用课题组自行研发的双通道放电低温等离子体反应器，双通道放电低温等离子体反应器结构如图1所示。

图 1 双通道放电低温等离子体反应器结构示意图注：1—电源;2—电极;3—绝缘板;4—绝缘套管; 5—空气等离子体区;6—螺旋鱼腥藻溶液。Fig.1 Structural diagram of dual channel discharge low temperature plasma reaction device

1.2 实验过程

1.2.1 藻种培养

将螺旋鱼腥藻接种在新鲜的BG11培养基中，放置在智能光照培养箱中培养至对数期，培养条件为(24±1) ℃，2 500 lx光照强度，光暗比L∶D=12 h∶12 h[41]。

1.2.2 除藻实验

以发育完好，生命力强的对数期螺旋鱼腥藻为研究对象，采用双通道放电低温等离子体反应器对其进行放电处理。以灭活率为衡量指标，通过改变双通道放电低温等离子体场的电气参数(电极-液面间距、放电时间和液层厚度)及螺旋鱼腥藻溶液液相体系因素(藻液初始浓度和初始pH值)等参数，进行灭活螺旋鱼腥藻的研究。

藻细胞的干重和悬浮液光密度(optical density，OD)具有良好的线性关系，因此以OD值作为藻液活细胞生物量(藻细胞浓度、细胞密度)的度量标准[42]。经紫外-可见吸收光谱测定，选择测定其在最大吸收波长680 nm处的OD值来反映放电处理对其灭活效果。螺旋鱼腥藻的灭活率(η，%)的计算公式为

(1)

式中：A0和At分别为处理前后螺旋鱼腥藻溶液在最大吸收波长处的光密度值。

1.3 理化性质

1.3.1 MDA含量

采用硫代巴比妥酸(TBA)法对MDA含量进行测定。测定一定量的离心后样品鲜重，再加入一定量的0.05 mol/L的磷酸缓冲液，冻融5次后进行离心，取离心后上清液2 mL，以1∶1比例加入质量分数为0.6%的TBA溶液，混匀后于100 ℃水浴30 min，冷却后以3 500 r/min速度离心10 min，取上清液分别于450、532和600 nm处测定OD值，MDA含量[CMDA, μmolg-1(FW)]计算方法为

CMDA=[6.45(OD532-OD600)-0.56OD450]V×

1 000/V1×155×W

(2)

式中：155 (mmol·cm-1)为消光系数；6.45为用经验公式求解的换算系数；V为提取液体积，mL；V1为测定用提取液体积，mL；W为样品鲜质量，g。

1.3.2 细胞膜相对通透性

取一定量经放电处理的螺旋鱼腥藻试样和空白样，测定电导率记为R1。而后在沸水浴中处理样品15 min，冷却至室温后测定电导率记为R2。为保证测定准确性，每个样品均测定3次取平均值。以相对电导率(电导率与总电导率的比值)来表示细胞膜的相对通透性，电导率(σ)计算公式为

σ=R1/R2×100%

(3)

式中：R1和R2分别为放电前后溶液的电导率。

2 结果与讨论

2.1 电气参数对螺旋鱼腥藻灭活效果的影响

2.1.1 电极-液面间距

在电源电压220 V，放电时间5 min，液层厚度10 mm，藻液初始OD值0.35的条件下，考察电极-液面间距变化对螺旋鱼腥藻灭活效果的影响，结果见图2。

图 2 电极-液面间距对螺旋鱼腥藻的灭活效果Fig.2 Inactivation effect of electrode liquid level spacing on Anabaena spiroides

在相同放电时间下，随着电极-液面间距的增大，螺旋鱼腥藻的灭活率先升后降。当电极-液面间距为2 mm时，放电5 min后螺旋鱼腥藻灭活率可达97%。电极-液面间距增加到5 mm以上时，同样的放电时间，灭活率不到76%。因为在产生等离子体的电极-液面间距范围内，电极-液面间距越小，其电场强度越大，易于生成高能电子及活性物种，有利于反应的进行；而随着电极-液面间距的增大，其电场强度变小，阻碍了高能电子的产生和加速电子的漂移，活性物种数量减少，反应不易进行，灭活率降低。且电极-液面间距变小时，液滴可能溅到电极表面，影响电极正常放电。考虑实验时的处理量，设定电极-液面间距为2 mm。

2.1.2 放电时间

设电源电压为220 V，电极-液面间距2 mm，液层厚度10 mm，藻液初始OD值0.35，考察放电时间对螺旋鱼腥藻灭活效果的影响，结果如图3所示。

图 3 放电时间对螺旋鱼腥藻的灭活效果Fig.3 Inactivation effect of discharge time on Anabaena spiroides

螺旋鱼腥藻的灭活率随着放电时间的延长而升高。放电1 min时灭活率仅为10%，而6 min时可达到99.2%。因为放电时间增加，产生的高能电子及活性物种浓度增大，与藻细胞的作用时间延长，细胞内部结构遭到破坏，细胞内容物外泄，导致细胞死亡。由此可知，低温等离子体放电短时间内便可实现对螺旋鱼腥藻的灭活。

2.1.3 液层厚度

设电源电压为220 V，电极-液面间距2 mm，放电时间5 min，初始藻液OD值为0.35，考察液层厚度改变对螺旋鱼腥藻灭活效果的影响，结果如图4所示。液层厚度在相同的处理液面面积下即代表着等离子体场中待处理的螺旋鱼腥藻溶液量。

图 4 液层厚度对螺旋鱼腥藻的灭活效果Fig.4 Inactivation effect of liquid layer thickness on Anabaena spiroides

由图4可以看出，随着液层厚度的增加，螺旋鱼腥藻的灭活率逐渐降低。液层厚度为5 mm时，放电处理5 min，螺旋鱼腥藻的灭活率为98.5%，基本上完全灭活；而液层厚度为13 mm时，相同的处理时间灭活率仅为55.7%。灭活率差距大的原因在于，放电生成的高能电子及活性物种较易进入液层厚度薄的溶液，可以与螺旋鱼腥藻充分接触并反应，而随着液层厚度的增加，螺旋鱼腥藻细胞数目增多，同时放电产生的高能电子和活性物种数量很难到达液层内部，导致灭活效率降低。虽然液层厚度增加灭活率会降低，但是可通过延长放电时间来保证较高的灭活率。同时考虑到藻液处理量不能太少，最终选择液层厚度为10 mm进行后续研究。

2.2 液相体系因素对螺旋鱼腥藻灭活效果的影响

2.2.1 藻液初始浓度

在电源电压为220 V，电极-液面间距2 mm，放电时间5 min，液层厚度10 mm的放电条件下，考察藻液初始浓度和放置培养时间对螺旋鱼腥藻灭活效果的影响，结果如图5所示。

图 5 藻液初始浓度对螺旋鱼腥藻的灭活效果Fig.5 Inactivation effect of initial concentration on Anabaena spiroides

从图5可以看出，放电当天随着藻液初始浓度的增加，在同一放电时间下，螺旋鱼腥藻的灭活率呈现逐渐下降的趋势。这是因为在一定的放电时间内低温等离子体产生的活性物种的数量有限，溶液初始浓度越大，进入放电区的藻细胞越多，同时由碰撞反应形成的中间产物也参与其中，藻细胞本身和其中间产物都争相与活性物种反应，使得藻细胞与活性物种反应几率降低，从而导致灭活率降低。

同一初始浓度的藻液随放置培养时间的延长，灭活率也逐渐提高。初始OD值为0.2和0.4的藻液在放置培养的第2天灭活率即达到100%。初始OD值为0.6、0.8和1.0藻液的灭活率也一直呈上升趋势，到第5天时灭活率最低也达到91%。这说明在放电完成之后，放电产生的活性物种的活性并没有立即消失，而是在放置培养期间继续存在于藻液中，并与藻细胞进一步反应，从而灭活率提高，并且处理效果基本不反弹。

虽然藻液初始浓度提高导致灭藻效果减弱，但可通过延长放电时间来保证较高的灭活率。相对其他处理方法，双通道放电低温等离子体完全灭活螺旋鱼腥藻所需时间仍然很短，即藻液初始浓度对螺旋鱼腥藻的灭活率无显著影响。

2.2.2 藻液初始pH值

在电源电压220 V，电极-液面间距2 mm，放电时间5 min，液层厚度10 mm，藻液初始OD值0.35的放电条件下，考察较适宜螺旋鱼腥藻生长的初始pH值(6～10)对螺旋鱼腥藻灭活率的影响，实验结果见图6。

图 6 藻液初始pH值对螺旋鱼腥藻的灭活效果Fig.6 Inactivation effect of initial pH on Anabaena spiroides

从图6可以看出，弱碱性藻液中螺旋鱼腥藻的灭活率均高于弱酸性藻液。放电当天，初始pH值为9的样品灭活率最高，为70%以上。放置培养后的第3天除pH为6的样品外，其余样品灭活率均超过95%；第5天，pH值为6的样品灭活率达到91%，其余样品灭活率均达到了100%。

蓝藻的生长环境一般为中性水体，随着蓝藻生长，其生长的水体会逐渐向微弱碱性变化。因为藻类光合作用消耗水体中的CO2，致使水中H+减少，pH值升高，使其水体pH值呈弱碱性。正常的藻细胞能够根据生长环境的变化调节溶液的pH值向适合自身生长的方向发展。但是，部分细胞由于自身修复功能受损而致使调节能力降低，不能及时修复生长水体环境而逐渐衰亡，并且在放电过程中产生大量的·OH，O3，H2O2等强氧化性物质。因此，在弱碱性溶液中，除了放电产生的直接效应外，在这一系列活性物种的氧化作用下，灭活率得到了提高。在螺旋鱼腥藻正常生长条件下，其生长环境pH值为弱碱性，故一般水体中若用双通道放电低温等离子体灭活时，pH值对灭活效果影响不大。

综上所述，确定本实验的最佳放电条件为：电极-液面间距2 mm，放电时间5 min，液层厚度10 mm，溶液初始OD值0.35，pH值为弱碱性。后续实验均以此条件为基础进行。

2.3 理化性质

2.3.1 MDA含量

丙二醛(MDA)是大量自由基对生物体进行氧化攻击，细胞膜中的脂类发生脂质过氧化反应生成的氧化终产物。MDA含量可体现细胞膜过氧化程度的高低，其产生和积累可作为间接反映细胞膜结构受损、藻细胞受胁迫程度的标志。

双通道放电低温等离子体处理对螺旋鱼腥藻细胞内MDA含量的影响如图7所示。

图 7 MDA含量变化Fig.7 Changes of MDA content

从图7可以看出，经双通道放电处理之后，藻细胞内MDA含量随放电时间延长而增加，随培养时间增加MDA含量先升后降。在放电当天MDA含量上升很快，处理10 min和20 min的样品MDA含量分别为1.39和1.65 μmol·g-1(FW)，与空白样[0.63 μmol·g-1(FW)]相比，分别上升120.63%和161.9%。空白样在放置培养期间，MDA含量基本不变。

以上结果说明，放电处理使细胞膜发生了脂质过氧化，·OH自由基等活性物种攻击细胞膜致其损伤，细胞质外溢，细胞开始解体。在放置培养后期，MDA含量有所下降，说明放置培养后期脂质过氧化作用减弱，可能是由于细胞膜内细胞器受损严重，达到细胞的耐受极限，无法维持其正常生命活动，引起藻细胞分解死亡。

2.3.2 细胞膜相对通透性

细胞膜是分隔细胞内外环境的重要屏障，细胞膜相对通透性的变化是反映细胞受损程度的重要标志。细胞膜具有磷脂双分子层结构，可看作是平行平板电容的电解质。因此，双通道放电低温等离子体对螺旋鱼腥藻细胞结构破坏的程度可由藻液电导率的变化来表示，反映螺旋鱼腥藻细胞膜的相对通透性[43]。

双通道放电低温等离子体放电处理前后细胞膜相对通透性的变化见图8。

图 8 细胞膜相对通透性变化Fig.8 Changes of cell membrane relative permeability

从图8可以看出，放电当天样品的细胞电解质外渗率随放电时间增加呈上升趋势，且均高于空白样。放置培养期间，细胞电解质外渗率先升后降，但基本均高于空白样，即放电处理过的藻细胞细胞膜相对通透性变大，说明细胞膜受损，内容物外泄，细胞开始解体。培养到第5天时，处理样的电解质外渗率下降很快，放电5 min样品已经低于空白样，这可能是因为细胞大部分已死亡，细胞膜破裂使得细胞内的非电解质溢出，使得电解率下降。

上述2个实验结果说明，经双通道放电低温等离子体处理后螺旋鱼腥藻的细胞结构遭到了严重破坏。MDA含量的变化表明细胞膜发生了脂质过氧化，细胞受到了破坏，细胞膜相对通透性的变大恰好验证了细胞膜结构的破坏。初步推测磷脂的降解过程如下：放电产生的·OH等活性物种首先攻击磷脂中的脂键及不饱和脂肪酸碳链，使其断裂，不饱和基团被·OH等活性物种氧化，生成过氧化物种，然后磷脂反应分解出来的羧酸脱羧生成CO2、H2O以及小分子的醛、酮等。分解后的产物在·OH等活性物种的继续氧化作用下可能生成CO2、H2O以及磷酸等无机小分子，如图9所示。

图 9 低温等离子体放电破坏细胞膜磷脂双分子层可能的反应途径Fig.9 Possible reaction pathway for the destruction of cell membrane lipid bilayer by low-temperature plasma

3 结 论

1) 双通道放电低温等离子体对螺旋鱼腥藻的灭活率随电极-液面间距和液层厚度的增大而降低；随放电时间的延长而升高；溶液液相体系因素对灭活效果无显著影响。

2) 经双通道放电低温等离子体处理后，藻细胞的生长受到严重破坏。MDA含量随放电时间的延长而增加；电解质渗出率也随放电时间的延长而增大，细胞膜相对通透性增大，细胞内容物泄漏。

3) 在电极-液面间距2 mm，放电时间5 min，液层厚度10 mm，溶液初始OD值0.35，pH值为弱碱性时，螺旋鱼腥藻的灭活率可达90%以上，且处理效果不反弹。说明双通道放电低温等离子体对螺旋鱼腥藻具有很好的灭活效果。