miR-221/222与乳腺癌ERα表达及他莫昔芬敏感性的关系

侯蕾 马源婧 霍欣欣 史学丽

小分子RNA（microRNA，miRNA）是近年来发现的一类不编码蛋白质的内源性短链RNA［1］。有研究表示，其可以通过种子序列与靶基因mRNA 3′端非编码区域（3′UTR）的核苷酸互补配对，直接降解沉默靶mRNA，从而在转录后水平调控基因表达［2］。miR-221/222 是内皮细胞高表达的微小RNA，均定位于人X 染色体中，两者的转录本和种子序列相同，有高度的同源性［3］。目前，miR-221/222 已被证实与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和侵袭转移等病理过程密切相关，并可作为肿瘤治疗的生物标记物［4］。在乳腺癌中，miR-221/222 在侵袭性较低的雌激素受体-α（estrogenreceptor-α，ERα）阳性乳腺癌细胞中呈低表达，miR-221 可以直接作用于ERα3′UTR区，与ERα 的表达相关。而ERα 是目前乳腺癌内分泌治疗的金标准，他莫昔芬（Tomaxifen，TAM）则是目前临床中内分泌治疗的一线用药，其也作为ERα的阻断剂被广泛应用于临床。有研究表示［5］，microRNA 可以通过药物特定的方法影响乳腺癌细胞的化疗过程中耐药性，一些内源性的microRNA 与TAM 的耐药及细胞的生长、凋亡相关；而miR-221/222 的靶基因与抑癌基因p27Kip1，凋亡因子c-kit、Bmf 相关，其可通过调控抑癌基因及凋亡因子参与肿瘤的发生和发展。本研究拟探究miR-221/222 与乳腺癌ERα 表达与他莫昔芬敏感性关系。

1 资料与方法

1.1 病例和标本

分析2019年1月至2021年12月石家庄市妇幼保健院104 例经乳腺癌切除术的患者资料。纳入标准：①患者均为女性；②首次接受乳腺癌切除术治疗的患者；③临床相关资料完成的患者。排除标准：有远处转移的乳腺癌患者。其中患者均为单侧乳腺浸润性癌，平均年龄（49.33±8.65）岁，按美国癌症联合会《AJCC 癌症分期手册》［6］进行TNM 分期，其中Ⅰ期28 例、Ⅱ期64 例、Ⅲ期12例。癌组织标本取自癌灶中央组织，癌旁组织取自距癌组织边缘≥1 cm 的组织。

1.2 免疫组织分析

所有组织标本均经甲醛固定、70%无水乙醇梯度脱水、石蜡包埋并切割成4 μm 的切片，对组织免疫组化染色，严格按照SP试剂盒的操作标准完成操作。

阅片时随机选择10 个视野观察细胞的表达情况，由两名资深阅片师，采用双盲法独立阅片（已知阳性片）。采用强度和数量积分相乘的方法对组织表达情况进行评价，其中强度评定标准［7］如下：阴性（-）计0分，浅棕色为弱阳性（+）计1 分，棕色为中度阳性（++）计2 分，深棕色为强阳性（+++）计3 分；其中和+为低表达，++和+++为高表达。量化评定标准［8］如下：阴性计为0 分，＜25%计为1 分，5%（含）～50%计为2 分，50%（含）～75%计为3分，≥75%计为4 分。

1.3 RNA 提取

根据RNA 提取试剂盒的操作标准对组织的总RNA 进行提取。将组织标本收集至EP 管中，加入1 mLTrizol 试剂，并使用组织研磨器进行研磨裂解处理；将组织与试剂充分混合后加入200 μL 氯仿，震荡30 s 后静置5～10 min。在1 200 rpm（离心半径为10 cm）离心后，取上清液，在加入500 μL 异丙醇沉淀离心，弃上清液，加入75%乙醇充分漂洗震荡后，离心弃上清液；将RNA 充分干燥后，加入20 μL DEPC 水溶解。采用分光光度计测定RNA 浓度。

1.4 细增殖抑制率和细胞凋亡率

将ERα 阳性人乳腺癌细胞株MCF-7 用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）及链霉素（100 μg/mL）的DMEM 培养基，于37℃、25%体积分数的CO2培养箱中孵育。取对数生长期的ERα 阳性人乳腺癌细胞，将其分为空白对照组、miR-221 抑制组、miR-222 抑制组、miR-221/222 抑制组，分别进行转染；在转染后，给予2MLTAM 5 μg/mL。

在转染后24、48 h 时取，采用MTT 法对各组吸光度（OD490）值进行测定，将孔板染色，每孔加20 μL MTT（5 mg/mL）工作液，常规培养4 h 后，吸去MTT 后在每孔中加入150 μL DMSO 慢摇混匀，使用酶标仪检测各孔OD 值，重复测定3 次后取平均值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1-处理组A/空白对照组A）×100%。

在转染后24、48 h 时取生长状态良好的细胞。接种培养24 h 后，弃培养液后加入PBS 洗涤两次，0.25%胰酶消化细胞后加完全培养基，离心弃上清，PBS 重悬计数，离心后弃去上清；在加入Binding Buffer 悬浮细胞，依次加入V-FTTC5μL、PI 10 μL 染色液。在室温下避光孵育5 min 以上后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 统计学方法

本研究采用统计学软件SPSS 24.0 对数据进行处理，计量资料采用（）表示，行t检验；多组间比较采用单因素方差分析进行检验，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-221/222 在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达水平比较

miR-221/222 在乳腺癌中的表达水平为（4.32±0.88）、（3.46±0.85）明显高于相应癌旁乳腺组织（2.32±0.76）、（2.15±0.59），差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 miR-221/222 在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达水平比较Figure 1 Comparison of the expression levels of Mir-221/222 in breast cancer tissues and adjacent tissues

2.2 miR-221/222 与乳腺癌病理组织表达的相关性

miR- 221/222 的表达水平在ER-α 表达阴性、PR 表达阴性组均显著高于阳性表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-221/222 的表达水平在Her-2 表达阳性显著高于阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）。在三阴性分子亚型中的表达显著高于Her-2 过表达型、luminal A 及luminal B1 型乳腺癌，差异有统计学意义（P＜0.05）；miR-221/222 的表达水平与患者的年龄、TNM 分期无关（P＞0.05）。见表1。

表1 乳腺癌组织中miR-221/222 表达水平与临床病理指标的相关性（±s）Table 1 Expression level of Mir-221/222 in breast cancer tissues and clinicopathological indicators Correlation（±s）

表1 乳腺癌组织中miR-221/222 表达水平与临床病理指标的相关性（±s）Table 1 Expression level of Mir-221/222 in breast cancer tissues and clinicopathological indicators Correlation（±s）

n年龄F/t 值0.856 P 值0.394 F/t 值1.922 P 值0.057 TNM 分期2.586 0.080 1.939 0.149 ERα 表达4.936＜0.001 7.039＜0.001 PR 表达3.723＜0.001 5.357＜0.001 Her-2 表达3.414＜0.001 9.827＜0.001分子分型病理指标≥50＜50Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期阴性阳性阴性阳性阴性阳性luminal A luminal B Her-2 过表达型三阴型38 66 16 58 30 32 72 44 60 58 44 13 44 30 17 miR-221 相对表达水平4.16±0.65 4.28±0.71 4.11±0.76 4.25±1.03 4.69±0.98 4.88±1.05 3.92±0.85 4.70±1.06 4.01±0.83 4.16±1.25 4.96±1.06 3.52±0.81 3.99±0.76 4.51±0.97 4.98±0.72 10.243＜0.001 miR-222 相对表达水平4.45±0.58 4.20±0.67 3.52±0.85 3.84±0.72 4.05±1.12 4.51±1.23 3.13±0.75 4.26±0.97 3.34±0.78 3.31±0.75 4.88±0.86 3.20±0.63 3.67±0.54 4.35±0.65 4.76±0.74 23.127＜0.001

2.3 各组细胞的增殖抑制率比较

在转染24、48 h 的各组的细胞增殖抑制率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较显示，miR-221 抑制组与对照组转染后24、48 h细胞增殖抑制率比较，差异均无统计学意义（P＜0.05）；miR-222 抑制组与miR-221 抑制组转染后24、48 h 细胞增殖抑制率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；miR-221/222 抑制组转染后24、48 h细胞增殖抑制率均明显高于其余三组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞的增殖抑制率比较（±s）Table 2 Comparison of proliferation inhibition rates among all groups（±s）

表2 各组细胞的增殖抑制率比较（±s）Table 2 Comparison of proliferation inhibition rates among all groups（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与miR-221 抑制组比较，bP＜0.05；与miR-222 抑制组比较，cP＜0.05。

组别空白对照组miR-221 抑制组miR-222 抑制组miR-221/222 抑制组F 值P 值6 6 6 6转染24 h 后3.62±0.79 3.81±0.84 3.75±0.80 6.88±1.03abc 19.736＜0.001转染48 h 后22.86±2.33 23.06±2.95 24.82±3.50 45.07±7.13abc 36.091＜0.001

2.4 各组细胞凋亡率比较

转染后24、48 h 各组的细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较，miR-221 抑制组与对照组转染后24、48 h 细胞凋亡率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；miR-222 抑制组与miR-221 抑制组转染后24、48 h 细胞凋亡率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；miR-221/222 抑制组转染后24、48 h 细胞凋亡率高于其余三组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组细胞凋亡率比较（±s）Table 3 Comparison of apoptosis rates in each group（±s）

表3 各组细胞凋亡率比较（±s）Table 3 Comparison of apoptosis rates in each group（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与miR-221 抑制组比较，bP＜0.05；与miR-222 抑制组比较，cP＜0.05。

组别空白对照组miR-221 抑制组miR-222 抑制组miR-221/222 抑制组F 值P 值n6 6 6 6转染24 h 后5.84±1.96 6.02±2.05 6.28±1.88 8.86±1.67abc 3.36 0.039转染48 h 后46.65±7.62 48.36±8.32 47.86±8.47 74.33±6.90abc 17.46＜0.001

3 讨论

乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的一种恶性肿瘤，其发生于乳腺上皮组织，严重威胁着女性的生命健康安全。乳腺癌作为雌激素依赖性的肿瘤，与雌激素水平密切相关，ERα 及PR 均为特殊功能蛋白，对乳腺癌的生长发展有一定的调节作用［9］，测定ERα 和PR 的表达情况对于乳腺癌的进展、治疗等具有一定的意义。近年研究表示，miRNA 可以通过调控肿瘤细胞发生、转移和侵袭等相关基因的表达，从而影响肿瘤生长、转移的过程；且miRNA 在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达存在一定差异，因此提示miRNA 与乳腺癌的发生个发展有着密切的关联［10］。

本研究结果表示，miR-221/222 在乳腺癌组织中的表达水平均明显高于相应癌旁乳腺组织。miRNA 可以下调凋亡程序性细胞死亡因子4 和Fas配体表达，抑制凋亡通路诱导的细胞死亡，从而导致乳腺癌细胞过度增殖，致使肿瘤发生；同时还可以通过调控细胞微环境来影响肿瘤细胞转移，同时，其能上调血管内皮生长因子A（VEGF-A）表达［11］，从而促进肿瘤组织内血管生成，加快肿瘤细胞生长和发展。外源性高表达的miR-221/222 可使影响细胞增殖分化的FOXO3 蛋白和使可以抑制G1/S 转换的P27 的表达下降，从而使MCF-7 细胞G1/S 期转变及细胞增殖。miRNA 表达作为乳腺癌发生的重要影响因素，miRNA 的表达异常与乳腺癌的病理学特征也有一定的关系。在本研究中miR-221/222 的表达水平在ERα 表达阴性、PR 表达阴性组均显著高于阳性表达组，miR-221/222 的表达水平在Her-2 表达阳性显著高于阴性组；在三阴型分子的表达显著高于Her-2 过表达型、luminal A 及luminal B1 型乳腺癌。ER 包含ERα 和ERβ 两个亚型，乳腺癌细胞ERα 和ERβ 的表达水平均会对癌细胞的增殖能力产生一定的影响，ERβ 可抑制乳腺癌细胞增殖，ERα 则可促进乳腺癌细胞的增殖［12］。miR-221/222的表达水平在ERα 表达阴性组明显高于阳性组，也提示miR-221/222 参与ERα 表达，对ER-α 表达有着负调节作用，影响着调节乳腺癌的发生和发展。且miR-221/222 可通过下调细胞因子信号转导抑制因子1 和周期蛋白依赖性激酶抑制因子1B，从而加快癌细胞进入S 期，并通过靶向磷酸酶和张力蛋白同源物/蛋白激酶B 通路使乳腺癌干细胞进行自我更新，影响乳腺癌细胞的生长和侵袭能力，因此miR-221/222 在三阴型乳腺癌中表达较高。

乳腺癌作为雌激素依赖性肿瘤，乳腺癌的发生与ERα 密切相关［13］，且乳腺癌中miR-221/222过表达可降低ER-α 的表达，且下调miR-221/222可以部分恢复ER-α 的表达和对他莫昔芬的敏感性。本研究中，miR-221/222 抑制组转染后24、48 h细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均明显高于空白对照组、miR-221 抑制组、miR-222 抑制组；共抑制miR-221/222 可明显降低细胞的增殖率和凋亡率，与方煜彤等研究结果一致［14］。也提示，抑制miR-221/222 可增加ER-α 阳性细胞对TAM 的敏感性，抑制miR-221/222 的表达可能会是影响临床对于内分泌耐药治疗靶点。

综上所述，miR-221/222 水平与腺癌患者的ERα 表达相关，其可通过调节ERα 的表达水平影响乳腺癌的生长、迁移和侵袭，同时可影响乳腺癌细胞对TAM 的敏感性，miR-221/222 有望成为乳腺癌预后判断的潜在标志物及治疗靶点，但还需要大量样本及数据进行进一步研究和证实。