酪酸梭菌活菌治疗对慢性乙型肝炎病人肠道菌群影响

王慧哲,崔云龙,严雄,史昌河,付慧玲,邹晓

(1 青岛大学附属青岛市中心医院乳腺外科,山东 青岛 266042； 2 青岛东海药业有限公司； 3 青岛大学附属青岛市中心医院病理科； 4 青岛市第六人民医院消化内科)

目前，乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个危害全球公共卫生安全的问题，有15%～40%的感染者会演变成慢性乙型肝炎(CHB)[1-2]。CHB会导致肝硬化、肝失代偿和肝细胞癌的患病风险增加，严重危害病人的健康和生活质量[3-4]。肠道与肝脏之间通过物质代谢、免疫调节和神经内分泌系统的相互作用，实现密切的功能协作[5]。肠道菌群结构的改变与CHB、乙醇性肝病、自身免疫性肝病、肝细胞癌等密切相关，对肝脏疾病的发展具有重要的诱导和促进作用[6-7]。有研究显示，微生态制剂中的益生菌能够定植于肠道中，增强肠道生物屏障功能，从而阻碍肝炎病毒的侵入[8]。酪酸梭菌作为微生态制剂，有助于维护肠道内微环境的平衡，但酪酸梭菌治疗CHB的临床研究较少。本研究旨在探讨应用酪酸梭菌活菌治疗对CHB病人肠道菌群和肝功能的影响。

1 资料与方法

1.1 对象与分组

选取2019—2020年青岛市第六人民医院的CHB病人53例和健康体检者28例。53例CHB病人，男39例，女14例，平均年龄(43.39±9.58)岁；28例健康人，男11例，女17例，平均年龄(32.64±12.99)岁。CHB病人与健康人之间性别、年龄比较差异无统计学意义。将CHB病人随机分为对照组和治疗组。对照组27例，男19例，女8例，平均年龄(43.81±9.32)岁；治疗组26例，男20例，女6例，平均年龄(42.96±10.00)岁。两组病人年龄、性别、病情、病程等一般资料比较差异均无统计学意义。

CHB病人入组标准：疾病符合《慢性乙型肝炎诊断标准(2015年版)》的诊断标准[9]；心、脑、肾等重要器官功能正常；既往均无肝脏手术史；未接受过肝移植；入组前6个月未使用过抗菌药等影响肠道菌群的药物。CHB病人排除标准：非乙型肝炎性肝病；伴自身免疫性、药物性、寄生虫性肝脏疾病；肝硬化和肝癌；伴人类免疫缺陷病毒(HIV)感染；营养不良；有精神病史或精神病病人；过敏体质或对酪酸梭菌活菌过敏病人。健康人入选标准：6个月内没有发生肠道疾病；6个月内没有使用过抗菌药等影响肠道菌群的药物；3个月内没有发生过任何疾病。

1.2 治疗方法

对照组病人给予常规抗病毒及保肝治疗，并嘱病人充分休息、合理膳食。抗病毒药用法：恩替卡韦分散片(润众，正大天晴药业集团股份有限公司)每次0.5 mg、每天1次口服；恩替卡韦片(齐鲁制药有限公司)每次0.5 mg、每天1次口服；富马酸替诺福韦二吡呋酯片(葛兰素史克有限公司)每次300 mg、每天1次口服。保肝药用法：异甘草酸镁(正大天晴药业集团股份有限公司)每次150 mg、每天1次静脉注射；注射用还原型谷胱甘肽(绿汀诺，山东绿叶制药有限公司)每次1 200 mg、每天1次静脉注射；丁二磺酸腺苷蛋氨酸(喜美欣，浙江海正药业股份有限公司)每次1 000 mg、每天1次静脉注射。抗病毒药物单独使用，给予病人持续治疗，本研究观察时间为6个月；保肝药物依据病人病情选用2～3种，连续应用1个月，之后5个月依据肝功能变化调整药物应用，积极预防各种并发症。治疗组在对照组治疗的基础上加用酪酸梭菌活菌(商品名阿泰宁，生产批号20200309，青岛东海药业有限公司生产)，每次1 260 mg、每天2次口服，连续服用6个月。

1.3 肝功能指标测定

取CHB病人清晨空腹静脉血5 mL，使用自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)水平。

1.4 粪便样本采集与分析

留取治疗前后CHB病人及健康人未被尿液污染的新鲜粪便标本，装入含有meta storage buffer保存液的无菌容器中，置于-80 ℃低温冰箱中保存。采用CTAB方法提取样本的基因组 DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和浓度，取适量的样品置于离心管中，使用无菌水稀释至 1 mg/L。以16S rRNA的V4区域为目标序列，对DNA样品进行PCR扩增。在通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACT-ACHVGGGTWTCTAAT-3′)的5′端加BGI-seq500的测序引物结合位点。用上述引物对16S rRNA的V4区域进行扩增。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10个循环；72 ℃延伸10 min。扩增结束后，再用带有BGI-seq500接头的引物进行扩增。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，20个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物使用15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳。将有目的条带的PCR产物进行等量混合，用20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，采用QIAGEN回收试剂盒回收DNA。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行DNA浓度的测定。进行BGI-seq500文库构建以及DNA的制备并测序。利用LefSe等生物信息学软件分析菌群差异。

1.5 统计学方法

使用R(v3.1.1)软件进行统计处理，计量资料以中位数(四分位距)即M(IQR)表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CHB病人和健康人肠道菌群的结构差异

对相对丰度差异排名前9的科水平物种丰度进行分析显示，CHB病人丰度高于健康人的科有7个(包括普雷沃菌科、链球菌科、丹毒丝菌科、红蝽菌科、臭杆菌科、疣微菌科和艰难杆菌科)，低于健康人的科有2个(包括克里斯滕森菌科和苏黎世杆菌科)，差异均有统计学意义(W=492～1 178，P<0.05)。见表1。

表1 健康人和CHB病人肠道菌群的结构差异(χ/%，M(IQR))

2.2 两组病人治疗前后酪酸梭菌、双歧杆菌和大肠埃希菌变化比较

治疗前，两组酪酸梭菌、双歧杆菌和大肠埃希菌占比比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后，两组酪酸梭菌和双歧杆菌占比均明显升高，但治疗组升高值明显高于对照组(H=19.893、11.219，P<0.05)；两组大肠埃希菌治疗前后差值比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 两组病人治疗前后肝功能指标变化比较

治疗前，两组血清ALT、AST和TBIL水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后，两组病人血清ALT、AST和TBIL水平均明显下降，但治疗组下降值明显高于对照组(W=2 732～3 054，P<0.05)。见表3。

表2 两组治疗前后酪酸梭菌、双歧杆菌和大肠埃希菌水平(χ/%，M(IQR))

表3 两组治疗前后肝功能指标变化比较(M(IQR))

3 讨 论

肠道菌群在肝脏疾病的进展和转归中扮演着重要角色[10]。越来越多的研究表明，肠道菌群能够调节机体的免疫稳态，使机体免受肝炎病毒侵害[11]。菌群多样性和丰度的改变会影响宿主对HBV的免疫应答[12]。CHB病人的肝功能受损后，肠道血液供应和蠕动减少，胆汁分泌异常，致使肠道黏膜损伤和菌群失调，菌群紊乱会导致促炎物质增多，并通过肠-肝轴和全身的循环系统诱导肝脏的炎症反应[5]。有研究表明，超过半数的肝病病人存在不同程度的肠道菌群紊乱，其中益生菌双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显减少，致病菌大肠埃希菌数量上升，毒力因子的多样性增加，导致内毒素生成与释放增加，从而诱导和促进肝脏损伤[13-14]。因此，对于肠道菌群的研究具有重要价值。

肠道菌群直接参与了维生素的产生、胆汁酸的降解、营养物质的消化以及机体的免疫[15]。其中普雷沃菌表面的脂多糖可诱导促炎基因的表达，增强炎症反应[16]。还有研究表明，普雷沃菌与代谢紊乱和系统炎症有关[17]。克里斯滕森菌在人类和动物肠道及黏膜中广泛存在，对宿主健康非常重要，与炎症等代谢疾病呈显著负相关[18]。本研究结果显示，与健康人相比，CHB病人多种菌群丰度发生显著变化，提示CHB病人肠道菌群结构发生了改变。其中普雷沃菌占比上升和克里斯滕森菌占比下降均促进了肝炎的进展，但是具体机制还需要深入研究。

有研究表明，微生态制剂中的益生菌能借助磷酸菌定植于肠道中，改善肠道菌群失调[19]。阿泰宁的主要成分为酪酸梭菌活菌，酪酸梭菌为革兰阳性厌氧菌，是一种耐酸性和抗腐败性很强的芽孢菌，能促进肠内双歧杆菌等有益菌增殖，抑制腐败菌的发育与增殖，维护肠道内微环境的平衡，同时通过产生酪酸促进肠黏膜修复[20]。阿泰宁可以改善人体细胞免疫功能，并利于有毒物质排出，使肠道恢复健康状态[21]。有实验研究表明，酪酸梭菌及其代谢产物可有效调节肠道微生态及纠正免疫功能紊乱，抑制炎症通路激活，从而减少细胞炎性因子的释放[22]。

本研究结果显示，口服酪酸梭菌后，其在肠道菌群中的占比明显上升，益生菌双歧杆菌丰度较治疗前也明显增加，并且治疗组的升高值明显高于对照组。由此可见，酪酸梭菌治疗可以调节病人肠道菌群结构，提升肠道内益生菌的水平。而致病菌大肠埃希菌丰度没有明显改变，可能是因为本研究观察周期较短。治疗组治疗后血清ALT、AST和TBIL水平显著下降，且下降值明显高于对照组。由此可见，口服补充酪酸梭菌活菌可以起到恢复肠道生物屏障、减少肝炎病毒对机体侵害、改善肝功能的作用。上述结果表明，肠道菌群结构改变在HBV诱导的慢性肝病进展中起着重要作用。

总之，应用酪酸梭菌辅助治疗CHB，能够调节肠道菌群结构，促使肠道内益生菌丰度增加，有效改善肝功能，可以作为CHB病人的有效治疗手段。