精氨酸支原体榆林株的分离鉴定

张慧莹，郝婷婷△，刘 刚，王田田，王运航，张雅雅，米耀云，李河林，敬晓棋*

(1.榆林学院 生命科学学院榆林市动物疾病诊断与检测重点实验室，陕西 榆林 719000；2.榆林市榆阳区动物疫病预防控制中心，陕西 榆林 719000；3.榆林学院 陕西省陕北绒山羊工程技术研究中心，陕西 榆林 719000；4.榆林学院 陕北羊产业发展协同创新中心，陕西 榆林 719000)

支原体肺炎是由多种支原体(Mycoplasmaspp，M.spp)引起人和动物以咳嗽、喘气、纤维素渗出为特征的急慢性传染病[1]。其中，绵羊支原体(Mycoplasmaovine，MO)[2]、丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidessubsp.Capri，Mmc)[3]、山羊支原体山羊亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.capricolum，Mcc)、山羊支原体肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.Capripneumoniae，Mccp)[4]的单纯或混合感染，可导致绵羊支原体肺炎及山羊传染性胸膜肺炎[5-6]。

精氨酸支原体(Mycoplasmaarginini，M.arginini)是一种常在微生物，可从人、牛、骆驼、绵羊等多种动物呼吸道组织中分离获得[7]。精氨酸支原体具有潜在的致病能力，当环境骤变、机体抵抗力降低时，可引起牛呼吸道感染，若与其他病原混合感染并侵入肺部，可导致肺部病变[7-8]。国内有文献报道，从山羊鼻拭子中分离到一株精氨酸支原体[9]，但目前未见从绵羊中分离到精氨酸支原体的报道。湖羊是我国优良的肉用绵羊品种，2019年以来，榆林市引入大量湖羊并进行规模化舍饲养殖。由于北方气候寒冷，圈舍密闭保温使空气质量下降，导致湖羊呼吸道疾病频发。患病羊临床表现为剧烈咳嗽、流鼻，体温升高至40 ℃以上，多种抗生素治疗无明显效果，且多数于发病5～7 d后死亡。为了更好的预防和控制该病，减少死亡和经济损失，本研究从临床早期急性发病病例中采集样品进行了病原的分离和鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 陕西省榆林市某湖羊场26日龄的发病羔羊，未用任何药物进行治疗。

1.1.2 试剂 PPLO培养基为GIBCO公司产品，特级马血清Solarbio公司产品(cat：S9050)，青霉素G钠购自山东齐鲁制药有限公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit，cat：DP304)、细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit：DP302)均为天根生化科技(北京)有限公司产品；PCR premix为宝生物(大连)有限公司产品；引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病例样本观察及剖解 在了解羊群发病和用药治疗情况的基础上，选择未用药的患病羔羊，观察其临床症状剖检后，无菌采集典型病变组织样品。

1.2.2 病原菌的初步鉴定 无菌剪取部分病料，涂片，革兰氏染色镜检观察。另取3 mm3病变组织置于含有0.5 mL生理盐水的1.5 mL EP管中，用研磨棒挤压、研磨，离心取上清，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，并以其此为模板进行PCR检测，反应体系为premix 10.0 μL、支原体目16s RNA基因引物Myco、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae)(表1)上下游各1.0 μL、模板DNA 5.0 μL、ddHO22.0 μL的PCR体系，扩增程序为95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(35个循环)，72 ℃延伸10 min。PCR后用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

表1 引物信息

1.2.3 病原分离培养 无菌采集肺脏病健结合处、眼观无明显变化的组织，研磨、离心后取上清接种于含10%马血清、80万IU/L 青霉素的液体PPLO培养基，37 ℃、5% CO2培养24 h，若培养基未见混浊则继续培养4 d。培养5 d时颜色变淡的培养物标记为P1代，将其用φ0.45 μm滤器过滤并再次接种PPLO液体连续传代，每代培养物均进行革兰氏染色、油镜观察。同时将P3代培养物接种于含20%马血清、80万IU/L 青霉素的固体PPLO培养基上，37 ℃、5% CO2条件下培养，5～7 d时在体视显微镜下观察菌落形态。

1.2.4 分离株种属鉴定 取第3代液体培养物3 mL，3 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀物用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，分别用M.spp、MO、Mcc、Mccp、Mmc、M.arginine等6个支原体引物(表1)进行PCR扩增，反应体系和程序同1.2.2。

1.2.5 分离株的遗传进化分析 将上述PCR扩增产物胶回收后送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI进行序列比对，并通过DNASTAR 11的MegAlign进行进化树分析。

2 结果与分析

2.1 病羊临床症状及剖检结果

羊场统计记录显示，该场湖羊发病率为26.56%，羔羊发病率较高，临床主要表现为咳嗽、流浓稠鼻液、呈典型腹式呼吸等。使用氟苯尼考、头孢噻呋钠等治疗，无明显效果，且发病羊在治疗7 d内死亡。剖解结果显示，肺组织部分为正常粉红色，部分组织暗红色、肉样变且覆盖大量纤维素性渗出物。

2.2 病原的初步鉴定

病料涂片革兰氏染色后镜检，未观察到典型细菌。肺组织病原核酸检测结果显示，支原体目扩增出275 bp的条带，与预期一致，而其余病原菌无特异性扩增条带(图1)。

图1 肺组织样品PCR检测

2.3 分离培养结果

每代液体培养物抹片革兰氏染色观察，菌体均为粉红色，形态不一，呈杆状、球状、短丝状或长丝状(图2)。第3代分离培养物PPLO固体培养上培养7 d后，形成大量圆形菌落，体视显微镜下观察可见菌落形态为典型的煎蛋样，中央乳头状突起(图3)。

图2 培养物革兰氏染色(1000×)

图3 菌落形态(10×)

2.4 分离株种属鉴定结果

以第3代培养物基因组DNA为模板进行PCR扩增，电泳结果表明，M.spp和M.arginine引物分别扩增出275 bp和546 bp的特异性条带，与预期大小一致，而MO、Mcc、Mccp、Mmc未见预期特异性扩增条带。

2.5 分离株测序结果及遗传进化分析

将测序结果在NCBI进行序列比对结果显示，与NCBI中已公布的U15794.1、HQ661827.1、NR_041743.1、GQ409971.1、JN935883.1、MN564911.1等20多株精氨酸支原体16S RNA序列相似性为100%(图4)，说明其为精氨酸支原体，命名为精氨酸支原体榆林株(M.arg YL strain)。遗传进化分析结果表明，分离株与其他精氨酸支原体均处于同一分支，亲缘关系最近，其次与MO Y98(NR_025989.1)较近，而与Mcc ATCC27343(NR_036952.1)、MCCP(NR_037061.1)、Mmc(NR_044772.1)亲缘关系最远(图5)。

图4 支原体榆林分离株种属鉴定

图5 精氨酸支原体榆林株(M.arg YL)系统发育树

3 讨 论

羊支原体肺炎是由多种支原体(Mycoplasmaspp)引起的以咳嗽、喘气、纤维素渗出为特征的急、慢性传染病[5]，影响羊的健康并导致严重的经济损失[1]。本研究中，发病羊场为存栏3万头的规模化湖羊场，场内不同年龄羊只均有发病，临床表现为间歇咳嗽、喘气，临床诊断为肺炎。对患病严重的病例采用氟苯尼考、头孢噻呋钠等抗生素治疗无明显效果，多数于发病5～7 d内死亡。因发病时间长、常规治疗群体症状无明显改变，结合发病羔羊病理剖检特征，推测该场湖羊肺炎可能是由支原体感染引起。为了确定其感染病原，先对未使用药物治疗的湖羊羔羊病料进行了常规抹片革兰氏染色镜检，进而利用本实验室设计的支原体目16s RNA、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌引物对肺组织病料核酸进行PCR扩增，电泳结果出现275 bp条带，与设计的支原体目16s RNA目标片段大小一致，而利用其它2种病原引物未扩增出目的条带，结果初确定患病羔羊肺炎是由支原体感染引起。

病原的分离鉴定是传染病诊断的黄金标准[10]，因此本研究对病变肺组织进行了常规的支原体分离培养，病原分离结果显示，经过3次传代的培养物革兰氏染色后，菌体为粉红色，形态不一，成杆状、球状、短丝状及长丝状，与支原体典型的多形性特征一致[11]。分离物接种于PPLO固体培养物上，37 ℃、5% CO2条件下培养7 d，观察到大量圆形菌落，体视显微镜下可见菌落中央乳头状突起，呈典型的煎蛋样形态[12]。因此，结合病羊症状、病理变化、分离培养物菌体特征及菌落形态可初步确定成功分离到了引起该场湖羊肺炎的病原为支原体。

尽管MO、Mmc、Mcc、MCCP等是引起绵羊支原体肺炎的主要病原，然而通过对10年的绵羊肺炎病原回溯检测显示，M.arginini也能够导致严重绵羊肺炎[13]，仅根据临床症状难以确定病原的种属。因此，本研究用M.spp、M.arginini、Mmc、Mcc、Mccp和MO的特异性引物对分离培养物进行了PCR鉴定，结果显示Mycoplasmaspp引物扩增出275 bp的目的片的同时，M.arginini引物也扩增出了546 bp的目的片段，而其他4种均没有目的产物。M.arginini的PCR产物测序后在NCBI中比对显示，该序列与Genebank中精氨酸支原体序列一致性为100%。因此，从PCR扩增和产物测序结果可以确定分离物为精氨酸支原体。

精氨酸支原体是多种动物呼吸道的常在微生物，有报道牛支原体肺炎(M.bovis)有17%的情况能够分离到精氨酸支原体，但不能确定是不是牛肺炎的关键病原[14]。然而，可以确定的是精氨酸支原体能够引起骆驼肺炎且能够传染人，具有较强的毒力和耐药性[15]。早在1985年Jones等[16-17]就报道了精氨酸支原体感染绵羊及其对绵羊组织器官的致病性。近来的研究多认为精氨酸支原体与溶血曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica，M.haemolytica)、多杀性巴士杆菌(Pasteurellamultocida，P.multocida)混合感染时表现出较强的致病性[13]，然而本研究中未分离到其他可疑的致病菌。限于时间和条件，本研究未进行病原致病性试验，但结合临床症状、病理解剖以及分离鉴定结果，可确定此次湖羊场发病是由于精氨酸支原体感染所致。

4 结 论

本研究结果表明，精氨酸支原体为该羊场湖羊肺炎的病原，结果将为榆林市湖羊肺炎的防控和治疗提供病原学基础。