基于网络药理学探讨独活-羌活-细辛治疗膝骨关节炎的作用机制*

卢 钰 ，保超宇 ，李具宝 ，尹本敬 ，刘 畅 ，邱荣能 ，潘斯学 ，何光雄 ，向俊宜 △

（1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南省中医医院，云南 昆明 650021；3.云南省第一人民医院，云南 昆明 650032）

膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种常见的膝关节退变性疾病，病理基础为关节软骨的退变和磨损、滑膜等关节结构的病变，导致关节的疼痛、变形及功能障碍[1-2]。随着我国老龄化社会的到来，其发病率逐年上升，需要手术的患者也越来越多，给社会带来巨大的负担[3-5]。中医药在治疗KOA方面具有独特的优势，且治疗方法多样[6-7]。通过中药外敷内服、针灸、药物注射、功能锻炼、减轻体重等措施对KOA患者进行保守治疗，对减轻患者临床症状、降低手术率具有重要意义[8]。我国传统中医药在KOA治疗方面具有悠久的历史和良好的疗效，其中本院的骨痹合剂在多年的KOA临床使用中获得了满意的疗效[9-10]，但是其作用机制尚不明确。骨痹合剂含有多种中药成分，其中的活性物质更是种类繁多。骨痹合剂具有补肝肾、强筋骨、祛风胜湿、散寒止痛、通筋活络等多种功效，其中独活-羌活-细辛药物组合在骨痹合剂中起着祛风胜湿、散寒止痛的作用。据文献报道，独活、羌活、细辛均显示抗炎镇痛的作用，其中，细辛可通过抑制炎症介质释放、降低毛细血管通透性等环节发挥抗炎作用[11]，独活、羌活也显示抗炎镇痛的作用[12]。独活、羌活、细辛常被用于治疗KOA，在多个方剂中均有使用，但这3味中药及其合用后对于KOA的治疗机制目前尚不明确。

网络药理学是基于系统生物学、多向药理学、计算生物学、数据库等多学科技术，通过高通量成分筛选、分子交换验证、结合网络分析等技术，分析药物与疾病之间互作关系的新兴学科，可以阐明药物的作用机制，预测其作用靶点、通路，还可用于方剂的验证、新药的研发设计[13-14]。该技术将“药物-靶点-疾病”之间的线性关系更替为“药物-多个活性成分-多个靶点-疾病”的网络关系，其具有的系统性和整体性与中医药的多种药物、多种有效成分完美匹配，为中医药的研究提供了更科学、更全面的新方法。本研究以网络药理学为基础，通过多个数据库的数据收集、特定软件进行数据分析，系统、全面地分析骨痹合剂中重要成分独活-羌活-细辛在治疗KOA中的作用机制，筛选和预测其中的关键靶点和通路，以明确骨痹合剂治疗KOA的部分作用。

1 资料与方法

1.1 成分靶点信息查询 在中药系统药理学数据库与分析平台 TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中检索并获得羌活、独活、细辛的活性成分和靶点，所有成分的筛选条件设置为口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18。

1.2 疾病靶点查找 以“knee osteoarthritis”为关键词，在 GeneCards（https：//www.genecards.org/），NCBI基因数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及 CTD数据库（http：//ctdbase.org/）进行人类基因检索，找出KOA已知的相关靶基因。

1.3 筛选共同靶点并构建PPI网络 将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，得到92个共有靶点，作为药物作用于疾病的预测靶点进行进一步的通路富集分析。将药物疾病共有靶点输入 String 数据库（https：//string-db.org/cgi/input.pl）进行PPI网络的构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，得到 PPI网络。

1.4 网络合并 为了更好地理解中药、成分、疾病以及相应靶点之间的复杂相互作用关系，以对应的中药、成分、治疗疾病以及作用靶点为基础，构建了成分-疾病-靶点网络图，导入Cytoscape 3.8.0中进行网络图的绘制，并同时绘制中药-成分-疾病-通路-靶点网络图，以便更直观地展示中药活性成分在治疗KOA过程中的多成分、多靶点的作用特点。

1.5 拓扑分析 将PPI网络导入Cytoscape 3.8.0中，通过NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析，以degree、betweenness centrality、average shortest path length和closeness centrality这四个参数为参考标准，通过degree排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点。

1.6 MCODE聚类分析 本研究通过MCODE分析进行关键基因的筛选。将已经构建好的PPI网络导入Cytoscape 3.8.0中，打开MCODE模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。具体结果见聚类分析文件夹。

1.7 关键成分筛选 将成分-疾病-靶点网络图，导入Cytoscape 3.8.0中进行拓扑分析。将成分进行degree排序，选取大于平均度值的成分作为关键活性成分。

1.8 GO富集分析和KEGG通路富集 将药物疾病共有靶点进行GO的生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cell component，CC）富集，引用 String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，将富集的结果导入R 3.6.3软件，安装并引用clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，进行柱状图和气泡图绘制。

将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，将富集的结果导入R 3.6.3软件，安装并引用clusterProfiler包后，进行柱状图和气泡图绘制。

2 结果

2.1 活性成分 羌活获得17个有效成分，52个靶点；独活获得11个有效成分，49个靶点；细辛获得8个有效成分，104个靶点。

2.2 疾病靶点筛选 经检索，在GeneCards数据库检索到2 040条相关基因，NCBI数据库获得148个基因，CTD数据库获得4 594个靶点。将这3个数据库的基因合并删重之后，得到5 768个KOA相关基因。

2.3 韦恩图及PPI网络 绘制出的韦恩图显示，药物、疾病共同靶点92个，见图1。得到的PPI网络图中有92个节点，738条边，平均度值为16。图2为string网站导出的PPI网络图，图3为Cytoscape软件绘制PPI网络图。图3中的节点颜色和大小根据度值调整，节点越大、颜色越深，则度值越大，线从粗到细表示edge betweenness从大到小。

图1 韦恩图

图2 String网站导出的蛋白相互作用关系网络图

图3 Cytoscape软件绘制的蛋白相互作用关系网络图

2.4 网络合并 以纳入的对应的中药、成分、治疗疾病以及作用靶点为基础，通过Cytoscape 3.8.0进行网络绘制，以便进一步地理解中药-成分-疾病-通路-靶点之间的关系，分别得到中药-成分-疾病靶点网络（图4）和中药-成分-疾病-通路-靶点网络（图5）。

图4 中药-成分-疾病靶点网络图

图5 中药-成分-疾病-通路-靶点网络图

2.5 拓扑分析和MCODE聚类分析 根据得到的PPI网络图，进行进一步分析。通过拓扑分析，总共筛选出36个关键靶点，将前20个靶点使用R 3.6.3进行图片绘制，横坐标为每个靶点的度值（图6）。通过聚类分析总共得到5个基因簇和4个核心基因，核心基因为 NOS3，ESR1，ACOX1 和 NR1I2（表1）。

表1 MCODE聚类分析得到的核心基因簇

图6 拓扑分析得出的关键靶点

2.6 关键成分筛选 通过将成分进行degree排序，得到8个关键成分（表2）。

表2 关键成分信息表

2.7 GO富集分析和KEGG通路富集 GO富集总共富集到1 254条生物过程，129项分子功能相关，59项细胞组成相关，将其绘制成柱状图（图7）和气泡图（图 ）。

图7 GO富集柱状图

图8 GO富集气泡图

KEGG富集总共富集到126条信号通路，绘制柱状图（图9）和气泡图（图10）。

图9 KEGG富集柱状图

图10 KEGG富集气泡图

3 讨论

膝骨关节炎属于中医“痹证”的范畴，由于年老体虚、正气不足、反复劳损，致肝肾精血亏损，加之复感风寒湿外邪，痹阻经络日久，气血运行不畅所致[15]。独活-羌活-细辛药物组合的应用已有千年历史，常用于治疗膝骨关节炎，具有祛风除湿、散寒止痛之功效[16]。目前独活中的部分化合物已有相关KOA的研究报道，其中，二氢欧芹素具有较强的镇痛和抗炎活性[17]，二氢欧芹醇能通过抑制NF-κB等途径来抑制IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、组胺等物质的释放来达到抗炎、镇痛作用[18]，香柑内酯能提高碱性磷酸酶的活性，促进I型胶原合成[19]；细辛、羌活也同样具有类似的抗炎、镇痛作用[20-21]。其中，细辛中的有效成分——槲皮素能有效抑制关节软骨破坏及关节滑液中IL-1β、TNF-α的水平[22]，进一步研究还发现，槲皮素可通过抑制p38MAPK通路相关因子表达而降低骨关节炎中的炎性因子表达，保护关节软骨[23]。而羌活中的4-methyl-3-trans-hexenylferulate、（－）-bornylferulate、4-methoxyphenethylferulate、phenethyl-ferulate能显著抑制NO分泌[24]，此外羌活中部分多炔类成分也表现出显著抑制NO分泌的作用[25]。因此，羌活具有抗炎能力，被广泛应用于骨关节炎的治疗中。但是由于中药成分复杂，作用于多个靶点、影响多个生物信号通路，并且不同药物之间还存在相互作用，所以目前的研究依然存在一定的局限性，并不能完全阐明中药治疗疾病的作用机制。

网络药理学利用日益健全的多个网络数据库，建立“中药-成分-靶点”与“疾病-基因-靶点”两个网络，通过相同靶点将两个网络进行映射、关联，从而找出疾病与药物成分之间的共同靶点，达到预测中药治疗疾病机制的目的。相较于既往采用实验验证药物作用机制的方法，网络药理学具有低成本、可重复的特点，并且网络药理学具有更为大量的样本量、更加全面，与中药成分的多样性更加适配，可作为后期实验研究的重要铺垫，减少实验验证的盲目性。

本研究通过数据挖掘，揭示独活-羌活-细辛有山柰酚、β-谷甾醇、芝麻脂素、异紫花前胡苷、紫花前胡苷、O-乙酰二氢欧山芹酯等关键成分，这些成分具有抗氧化、抗炎、镇痛等作用。独活-羌活-细辛与膝骨关节之间存在92个共有靶点，通过建立中药-成分-疾病靶点网络以及中药-成分-疾病-通路-靶点网络图，更直观地反映独活-羌活-细辛药物组合在治疗KOA的复杂作用机制。

通过Cytoscape进行拓扑分析，发现AKT1、ESR1、JUN、CASP3等为关键靶点，其中多项研究表明AKT1可以增加骨关节炎软骨细胞增殖并且抑制其凋亡，是骨关节炎的治疗的重要靶点[26]，由此延伸出许多针对AKT1靶点基因的研究[27]；JUN蛋白在骨关节炎患者体内的表达显著升高，抑制B细胞活化转录因子/JUN的转录活性，减少MMP的表达，减轻OA小鼠的软骨细胞损伤[28]；ESR1同样能抑制软骨细胞凋亡，促进软骨细胞增殖[29]；CASP3在膝骨关节炎患者中表达显著增加，与软骨细胞凋亡有关[30]。

MCODE聚类分析找出了其中的核心基因NOS3、ESR1、ACOX1、NR1I2。XbaI和 PvuII限制酶识别位点在ESR1基因中的多态性与多种疾病有关，其中包括骨关节炎[31]，进一步的研究认为ESR1中rs2234693的多态性与KOA的发生存在相关性[32]；NR1I2可以激活p16-CDK 4/6-pRb-E2F信号通路，减轻软骨细胞的氧化应激和细胞衰老，从而达到治疗膝骨关节的目的[33]；目前部分研究认为ACOX1与肝细胞内脂肪沉积和某些癌症具有相关性，但是缺乏ACOX1与膝骨关节炎的相关研究[34]；有研究认为NOS3与阿尔茨海默病、高血压、脑卒中等多种疾病相关，缺乏研究证明NOS3与膝骨关节炎存在相关性，甚至有研究认为NOS3与骨关节炎之间并没有相关性[35]。对此情况，笔者认为，网络药理学也存在其不足之处，可能导致了本次研究结果的偏颇，但是ACOX1、NOS3也可能是膝骨关节炎的相关基因，只是目前尚未明确，这也为未来的研究提供了新的方向。

通过GO富集分析进一步确定了独活-羌活-细辛可能起作用的生物过程、信号通路、分子功能、细胞组分，其中主要有类固醇激素反应性、脂多糖反应性、脂肪酸代谢过程、活性氧代谢过程、对细菌分子、药物、抗生素反应性以及对异物来源的反应及细胞反应，提示独活-羌活-细辛可能通过调节这些生物过程来治疗膝骨关节炎。有研究认为类固醇激素水平可能与男性全膝、全髋关节置换术存在相关性[36]，但是目前的研究还不能准确阐明其机制和相关性[37]；脂多糖可以诱导软骨细胞的凋亡，促进骨关节炎的发生，而抑制脂多糖可以减少软骨细胞的凋亡[38]；脂肪酸代谢过程也与骨关节炎存在相关性，不饱和脂肪酸可能对预防骨关节炎有益，而饱和脂肪酸则相反[39]；关节内的氧化应激和活性氧过高会导致软骨细胞衰老和凋亡，细胞外基质合成和降解以及滑膜炎症和软骨下骨功能障碍[40]。其余生物过程也有部分已经被证明与膝骨关节炎密切相关，也有部分缺乏相关研究。

KEGG通路富集的结果中，主要有AGE-RAGE通路和TNF通路。AGE-RAGE通过引起软骨基质降解与软骨细胞凋亡以及促进软骨及滑膜组织的炎性反应等方式在OA发病中发挥重要作用，并且通过抑制AGE-RAGE通路可以明显减缓骨关节炎病程发展[41]。TNF作为重要的炎症因子，介导多种炎症反应，在骨关节炎的发展中至关重要[42]。

本研究基于网络药理学的方法，从分子生物学的角度证明了骨痹合剂治疗膝骨关节炎的有效性，初步预测了独活-羌活-细辛治疗膝骨关节炎的有效化学成分，可能的信号通路、生物过程、核心基因，为后续独活-羌活-细辛治疗膝骨关节炎有效成分的分析和作用机制探索提供了参考方向和依据。