温胆汤对失眠小鼠脑组织线粒体结构和功能的影响

李莉 刘茹 何晶 陈云 郭娟 陈红 刘玲

(湖北中医药大学，湖北 武汉 430065)

失眠为最常见的睡眠障碍和第二大精神障碍〔1〕，其主要特征为睡眠质量、睡眠启动或睡眠维持不佳，并伴有严重的痛苦和日间功能障碍〔2〕。据估计，大约有30%的成年人受到睡眠障碍的困扰，其中6%～10%被诊断为失眠〔3〕，其主要见于年龄较大人群〔2〕。一项有关失眠在我国普通人群中的综合发病率Meta分析显示，我国失眠综合患病率为15%，且正在逐步年轻化，平均年龄小于43.7岁的患病率明显高于43.7岁及以上人群〔4〕。长期失眠会诱发多种疾病，同时，失眠也是抑郁症、躁郁症、焦虑症、糖尿病等多种疾病的常见的并发症〔5,6〕。目前，西医治疗失眠的主要手段为药物治疗和认知行为疗法，但由于药物往往会引起过度镇静、耐受、成瘾和神经毒性等不良反应及认知行为疗法的资源稀缺、费用昂贵，难以推广等问题〔3〕，许多失眠患者转而求助于非处方药物。中药是我国最常见的治疗失眠的方法之一，温胆汤最初记载于姚僧垣所著的《集验方》中，主要用于治疗由“痰”而引起的各种病症〔7〕。中医认为，失眠病位在心，与五脏六腑密切相关，病机为痰热内扰〔8〕。既往研究结果显示，温胆汤及其加减方可显著改善失眠患者睡眠质量，并具有作用温和、副作用小及治疗复发率低等优点〔9〕。近来，研究表明睡眠障碍会对线粒体造成影响〔10〕。大脑具有较高的代谢率和能量需求，线粒体作为细胞产能的主要场所，大脑很大程度上依赖于线粒体功能〔11〕，因此，本研究通过构建失眠小鼠模型探究温胆汤对失眠小鼠脑组织线粒体的作用。

1 材料与方法

1.1主要材料 温胆汤方剂由湖北省中医院门诊中药房提供，方剂配方为半夏(6 g，批号：19021091)、竹茹(6 g，批号：18122371)、麸炒枳实(6 g，批号：19031361)、陈皮(9 g，批号：19051171)、炙甘草(3 g，批号：19040261)、茯苓(4.5 g，批号：19061131)。方剂进行二次煎制，第一次，加入药材8倍量水，煎至沸腾后，持续40 min，过滤取汁；第二次，加入药材6倍量水，煎至沸腾后持续30 min，过滤取汁，两次汁液混合后，浓缩成1∶1药液备用。

实验用4～5周龄SPF级昆明种雌性小鼠由三峡大学提供，共30只，体重为(20±2)g，合格证No.42010200003462，实验动物使用许可证号SYXK(鄂)2018-0104。实验用主要试剂包括艾司唑仑片(华中药业股份有限公司，襄阳)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，北京，货号：R0010、PC0020)；兔抗己糖激酶(HK)1、HK2、葡萄糖转运蛋白(GLUT)1、β-actin抗体，羊抗兔二抗(武汉贝茵莱生物科技有限公司，武汉，货号：PAB30519、PAB30271、MAB37348、PAB36265、SAB43714)；线粒体膜电位检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，上海，货号：C2006)；三磷酸腺苷(ATP)含量测试盒、乳酸测试盒(南京建成生物工程研究所，南京，货号：A095-1-1、A019-2-1)；锇酸(Ted Pella Inc，美国，货号：18456)；醋酸铀(Merck KGaA，德国，货号：1005-25g)；戊二醛(国药集团化学试剂有限公司，上海，货号：30092436)。实验用主要仪器包括全自动化学发光分析仪(上海天能科技有限公司，上海，型号：Tanon-5200)；流式细胞仪(ACEA，美国，型号：NovoCyte)；酶标仪(Ladsystems，美国，型号：MK3)；透射电镜(日立，日本，型号：HT7700)。

1.2方法

1.2.1构建失眠小鼠模型 30只SPF级昆明种雌性小鼠，随机挑取24只采用改良版水平转盘睡眠剥夺法构建失眠模型〔12〕。使用亚克力塑料板构建一个长为110 cm、宽为60 cm、高为40 cm的睡眠剥夺箱，以10 cm的纵向距离和13 cm的横向距离为标准，在其底部固定15个高为8 cm、直径为6.5 cm的圆柱形平台，注入23～25℃水至平台下1 cm处，保持水温。待小鼠适应性培养7 d后，对待造模小鼠进行站立训练，将其放置于圆柱平台上，当小鼠即将入睡时，由于肌肉松弛垂头触水或落入水中而惊醒，使其被迫保持清醒站立。造模期间(2 w)，小鼠于早晚各拿出休息1次，每次30 min，每2 d记录1次小鼠行为学改变(精神状态、饮食)、毛发和体重变化。

1.2.2分组与处理 24只失眠模型小鼠随机等分为4组，分别为模型组、温胆汤低剂量组(10 mg/kg)、温胆汤高剂量组(45 mg/kg)及艾司唑仑片组(0.15 mg/kg)，剩余6只未造模小鼠设置为正常对照组。站立训练第2周(第8天)开始进行灌胃给药处理，每次给予0.5 ml药液灌胃，正常对照组及模型组小鼠给予0.5 ml蒸馏水灌胃。末次灌胃给药12 h后，戊巴比妥钠过量麻醉处死小鼠(100 mg/kg)，收集脑组织，于-80℃保存。

1.2.3透射电镜观察海马组织和下丘脑线粒体形态 取各组小鼠海马组织及下丘脑，于4℃下，使用2.5%戊二醛预固定30 min以上，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，每次10 min。使用1%锇酸后固定1 h后，经梯度乙醇和梯度丙酮处理脱水，丙酮与环氧树脂进行半浸透，纯环氧树脂进行全浸透。对固定、脱水、浸透后的样本进行包埋处理和切片处理，得到60 nm超薄切片，使用醋酸铀避光染色20 min，双蒸水水洗3次，吸干，枸橼酸铅避光染色15 min后，透射电镜观察线粒体形态。

1.2.4流式细胞仪检测脑组织细胞线粒体膜电位 收集各组小鼠脑组织细胞悬液，取1×106个细胞，重悬于0.5 ml细胞培养液中，并加入0.5 ml JC-1染色工作液，混合均匀，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育20 min。400 r/min离心3 min，收集沉淀，JC-1染色缓冲液洗涤2次，加入1 ml JC-1染色工作液重悬细胞，400 r/min离心3 min，重复以上步骤2次，加入400 μl JC-1染色缓冲液重悬细胞，上机检测，并使用NovoCyte分析软件对其进行分析。

1.2.5生化检测脑组织中ATP乳酸浓度 取各组小鼠脑组织样本，根据ATP及乳酸检测试剂盒说明书进行操作，测定其浓度。

1.2.6Western印迹检测脑组织HK1、HK2和GLUT1表达水平 取各组小鼠脑组织样本，将其剪成细小碎片，按10 μl/mg的量加入裂解液，裂解至完全裂解，于4℃下，12 000 r/min离心15 min，测定上清液蛋白浓度，根据其结果上样至SDS-PAGE凝胶，电泳分离蛋白后转膜至PVDF膜。使用5%脱脂牛奶于4℃低温环境中封闭过夜，加入1∶1 000稀释的HK1、HK2、GLUT1、β-actin抗体，室温孵育1 h，PBST洗涤5 min，重复洗涤3次，加入1∶20 000稀释二抗，室温孵育1 h，PBST洗涤5 min，重复洗涤3次。于暗室中加入ECL发光液进行反应后，在全自动化学发光分析仪中检测结果并读取灰度值，以β-actin为内参分析其灰度值。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1温胆汤方剂对失眠小鼠体重的影响 与正常对照组〔(34.02±2.55)g〕比较，失眠模型组精神状态及毛发较差，饮食量减少，体重〔(19.60±0.72)g〕显著减轻(P<0.05)。与模型组比较，温胆汤低剂量组〔(23.52±0.84)g〕、高剂量组〔(26.13±1.73)g〕及艾司唑仑片组体重〔(28.75±1.67)g〕显著增加(P<0.05)，小鼠的精神状态、毛发及饮食情况均得到改善。

2.2温胆汤方剂对失眠小鼠脑组织线粒体结构的影响 正常对照组海马组织和下丘脑中线粒体数量较多，其形态正常，线粒体嵴清晰。失眠模型组海马组织和下丘脑中线粒体数量减少，线粒体出现明显肿胀、破损，大部分嵴断裂、溶解，出现空白区域，形成空泡样。与模型组比较，温胆汤方剂组及艾司唑仑片组脑组织中线粒体损伤有所改善，且温胆汤方剂高剂量组的改善效果优于温胆汤方剂低剂量组。见图1。

图1 各组海马组织及下丘脑线粒体结构比较(×8 000)

2.3温胆汤方剂对失眠小鼠脑组织线粒体膜电位的影响 流式检测各组脑组织细胞线粒体膜电位结果显示，较正常对照组〔(8.81±0.60)%〕，模型组线粒体膜电位下降细胞所占比例〔(46.58±0.77)%〕显著增加(P<0.05)。给药干预后，与模型组相比，温胆汤低剂量〔(34.23±1.35)%〕、温胆汤高剂量组〔(23.56±0.65)%〕及艾司唑仑片组中线粒体膜电位下降细胞所占比例〔(20.79±0.33)%〕均显著减少(P<0.05)，且温胆汤方剂高剂量组减少效果显著优于温胆汤方剂低剂量组(P<0.05)。见图2。

图2 流式细胞仪检测各组脑组织细胞线粒体膜电位变化

2.4温胆汤方剂对失眠小鼠脑组织线粒体功能的影响 与正常对照组比较，模型组脑组织中ATP浓度降低，乳酸浓度增加，差异有统计学意义(P<0.05)。经温胆汤方剂和艾司唑仑片干预治疗后，ATP及乳酸浓度降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且温胆汤高剂量组的影响效果高于低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.5温胆汤方剂对失眠小鼠脑组HK1、HK2和GLUT1表达的影响 与正常对照组比较，模型组脑组织中HK1、HK2和GLUT1表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，温胆汤低、高剂量组及艾司唑仑片组脑组织中HK1、HK2和GLUT1表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，且温胆汤浓度越高，表达下降越多(P<0.05)。见表1、图3。

表1 各组脑组织ATP、乳酸水平及HK1、HK2和GLUT1蛋白表达水平比较

1～5：正常对照组，模型组，温胆汤低剂量组，温胆汤高剂量组，艾司唑仑片组图3 Western印迹检测脑组织HK1、HK2和GLUT1蛋白表达水平

3 讨 论

失眠可影响各年龄阶层人群，但其多发与于妇女及老年人群〔2〕。近年来，随着快速的城市化和工业化，年轻人经常面临职业压力，夜间长时间工作，及其对电脑、智能手机等新媒体的广泛使用等问题，打乱了其生物睡眠节奏，诱发导致年轻人群中失眠发病率增加〔4〕。中医认为失眠病因多为虚实两证，即肝郁、痰热、心火等相关实证和心脾气血虚弱有关虚证。温胆汤温凉兼顾，以半夏为君药，竹茹为臣药，君臣相伍，合并燥湿化痰及清热化痰之效，同时辅以陈皮和枳壳理气化痰，茯苓健脾渗湿、绝生痰之源，以达治疗失眠之效〔8〕。本研究结果进一步证明了温胆汤具有缓解失眠症状的疗效。

在现代医学中，下丘脑作为觉醒、睡眠中枢与具有睡眠调节作用、促进慢波睡眠的海马组织是失眠研究的重要观察点〔13,14〕。线粒体作为以ATP的形式提供细胞95%能量的细胞器对神经元的兴奋性、生存以及各脑组织功能的维持至关重要〔15〕。研究表明，失眠将导致大脑组织线粒体结构损坏和功能障碍〔15〕。短暂的睡眠时间会增加线粒体活性氧(ROS)的产生、脂质的过氧化作用及氧化应激反应相关的基因的表达〔10〕，同时线粒体作为细胞氧化应激损伤的靶器官，可导致线粒体发生氧化应激损伤〔16〕。田苗等〔17〕及徐磊等〔18〕分别证明了不同加味温胆汤可减轻肝脏线粒体氧化应激反应或减轻肠组织线粒体结构损伤。本研究结果提示，温胆汤方剂可缓解失眠小鼠脑组织线粒体结构损伤和功能障碍。

既往研究表明，细胞线粒体功能障碍可表现为糖酵解优于氧化磷酸化，糖酵解途径生成乳酸，其途径ATP生成小于氧化磷酸化途径，从而导致细胞呼吸过程中乳酸生成增多，ATP生成减少〔19～21〕。Wisor等〔22〕研究发现，在强迫清醒的过程中脑组织乳酸生成增加。本研究结果提示，失眠小鼠脑细胞糖酵解增强，进一步解释了失眠小鼠脑组织ATP浓度降低的可能机制为糖酵解优于氧化磷酸化。GLUT1是促进性GLUT转运蛋白家族(SLC2)成员，是哺乳动物细胞中最保守、分布最广的葡萄糖转运蛋白〔23〕。Cho等〔23〕研究显示，GLUT1上调可有助于糖酵解速率和乳酸生成的增加。HK为糖酵解途径的关键限速酶之一，降低其活性可降低细胞糖酵解水平〔24〕。因此，GLUT1及HK可用于衡量糖酵解水平。本研究结果显示，进一步提示温胆汤可缓解失眠小鼠脑组织线粒体功能障碍。