早熟棉转基因研究进展

刘 圆，肖娟丽，张安红，2，王志安，赵战胜，罗晓丽，2*

(1.山西农业大学棉花研究所，山西运城 044000；2.棉花种质资源利用与分子设计育种山西省重点实验室，山西运城 044000；3.新疆生产建设兵团第六师农业科学研究所，新疆五家渠 831300)

早熟棉是适宜缓解当前粮棉争地、植棉面积逐渐减少现状的一种棉花类型，其最主要的特点是生育期短、适于晚春播、初夏播或夏播，可以与冬小麦、油菜等冬季作物实现粮棉一年两熟，提高复种指数，在增加粮食产量、保证粮食安全的同时，确保棉花的种植面积及产量，为国家农业战略的实施提供坚实的基础[1-2]。在春季气温低、秋季气温下降快、光热条件差、降水少的西北内陆地区，丘陵、山区较多且无霜期较短的华北地区，如辽宁、新疆、甘肃、内蒙古等地种植早熟棉还可以提高棉花的霜前花率，改善棉花品质[3]。尤其是新疆位于温带大陆性气候区，夏季降水少，多晴天，昼夜温差大；纬度较高，夏季白昼较长，光照充足；位于塔里木盆地边缘山麓地带，高山冰雪融水丰富，灌溉便利；多沙质土壤，透气性好，有利于棉花生长；收获季节多晴朗天气，有利于棉花采摘；冬季气温低，有利于杀死棉花病虫害。这些得天独厚的光、热资源等便利条件，使得新疆棉花以色泽洁白、纤维品质好而深受棉纺织企业和消费者青睐。自20世纪90年代中期以来，以新疆为主产区的西北内陆棉区成为全国优势产区，据国家统计局数据，2015年以来，新疆棉花播种面积常年占全国播种面积的60%以上，2019年达到76%，2020年新疆棉花产量占全国总产量的87.3%[4-6]。新疆南北疆共有37个主要棉地，其中北疆21个以种植早熟棉品种为主，南疆16个以种植中早熟棉品种为主。

由于新疆地处西北内陆，常年降雨较少，并且耕地普遍有不同程度的沙化，与之伴随而来的盐碱化和次生盐碱化现象较为严重；此外常年连作造成了病虫害的发生和棉田杂草危害日趋严重，极大地限制了新疆棉花种植业的发展。因此，生产上急需高产优质，同时兼具抗旱、耐盐碱和抗病虫害的早熟棉花新品种。而通过常规的育种手段在短时间内是很难实现的。因此，培育优良的早熟棉品种，对优化种植结构，提高种植效益具有重要的意义。随着生物技术的快速发展，通过基因工程手段解决上述问题成为了可能。例如，我国在转基因棉花的研究中已经取得了较大的成绩，转基因抗虫棉花已经得到大规模的应用[7-14]。转基因棉花大部分为农杆菌介导转化，这就离不开棉花的组织培养和体细胞胚胎发生，但棉花体细胞胚胎发生受基因型限制[15-16]，阻碍了生物技术在棉花遗传改良中的广泛应用和迅速发展。

早熟棉的体细胞胚胎发生受基因型限制尤其严重，目前国内转基因棉花的受体亲本大部分是生育期在180 d以上的中熟棉，具有目标性状的转基因中熟棉和优良早熟棉进行杂交转育，存在花期不遇的现象，如通过栽培调整花期后杂交转育成功，则后代出现生育期延长不能在早熟棉区种植，这种现象阻碍了生物技术在早熟棉遗传改良中的广泛应用和迅速发展，在棉花转基因工程的研究中，除了分离、克隆目标基因，构建高效表达载体等技术外，从适用于大田生产上广泛使用的早熟棉中筛选体细胞能够再生的品种，通过组织培养技术和常规育种技术筛选出体细胞胚胎高频再生的受体材料，建立一套广为适用的早熟棉组织培养快速再生体系是早熟棉转基因成功的关键因素，因此相关学者在早熟棉体细胞再生方面做了大量的研究工作，并取得了可喜的成绩。但是能够体细胞再生的早熟棉种质资源很少，所以拓展早熟棉花再生基因型、筛选高频再生品(种)系或株系，对于早熟棉花基因工程具有重要意义。

该研究对我国近年来早熟棉体细胞再生和早熟棉转基因研究的进展做了总结，遴选出了能够候选为转化受体的早熟棉优良品种，并对早熟棉转基因研究提出了展望，以期为创制抗病虫、抗除草剂、抗旱和耐盐碱的早熟棉新种质奠定基础。

1 国内早熟棉体细胞再生研究进展

自张宝红等[17]将泗棉3号进行组织培养，获得了具有高频胚胎发生的愈伤组织、胚状体和小植株后，朱生伟等[18]以陆地棉(GossypiumhirsutumL.)新疆推广品种“新陆早4号”进行体细胞再生研究并在6～7个月获得了再生植株。于娅等[19]以陆地棉“中棉所24”为材料进行了全固体体细胞培养，获得了愈伤组织和再生植株。王芳等[20]对新疆2个陆地棉品种新陆早1号、新陆早7号的胚状体发生及植株再生进行研究，结果表明胚状体发生、萌发、成苗各阶段，品种间存在明显差异。正常植株率最高分别达65.7%、85.7%。周小凤等[21]以15个新疆主栽优良品种(系)以及2个对照品种ZY-1和Y668为研究对象，利用下胚轴做外植体进行胚胎发生能力的比较研究，筛选出5个能够胚胎发生的基因型，即新陆早12、新陆早17、新陆早22、新陆早32和新陆早33，其中新陆早32和新陆早33能在3个月左右分化，且分化率较高，可达90%左右，具备作为棉花优良遗传转化受体的基本特征。

陈天子等[22]以新疆4个主栽棉花品种新陆中20、新陆早24、新陆早 33和 03298为材料，通过不同浓度的激素组合成功地诱导获得了体细胞胚并在6～8个月内获得了再生植株。严勇亮等[23]以新疆棉区的新陆中15号、新陆中18号、系9、黄河流域棉区的中棉所35号、中棉所44号及对照品种柯字312为研究对象，比较新疆和黄河流域2个生态区棉花品种的体细胞再生能力，优化棉花体细胞胚胎发生的相关条件参数，除新陆中18号外其他5个获得了再生植株，建立高效棉花体细胞再生体系，并且得出新疆棉区和黄河流域棉花品种的植株再生潜力没有明显差别，新陆中15号的愈伤组织分化率及胚胎萌发率都比较高，具备作为棉花优良遗传转化受体的基本特征，但新疆棉花品种细胞胚胎发生所需的时间长的结论。罗晓丽等[24]以8个早熟或特早熟棉花为材料，通过不同激素组合(1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L KT、0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT)诱导其愈伤组织，成功使晋棉5号、中棉所27号和辽棉10号3个早熟棉品种在5～7个月内通过体细胞胚胎分化获得再生小苗。周晶等[25]以新疆陆地棉主栽品种新陆早19号和新陆早23号下胚轴为外植体，通过对再生体系的研究，首次获得了胚性愈伤组织并在6～8个月获得了大量再生植株。刘丽等[26]以新疆主栽品种新陆早32号、33号和对照YZ1为研究材料，通过不同浓度的激素组合成功诱导获得了体细胞胚，并在8个月内都成功得到再生苗。焦天奇等[27]以新陆早33号为对照研究新疆主栽品种新陆早42号的体细胞胚胎发生，新陆早42号在140 d内获得了有根系发育良好的能嫁接植株(株高7～8 cm)。李鹏飞等[28]以新疆棉区主栽品种新陆早33 号和新彩棉7 号为试验材料，比较不同激素组合对二者体细胞胚胎发生过程的影响，在6个月内获得再生植株。李有忠等[29]以新疆主栽早熟棉品种新陆早13号、新陆早26号、新陆早33号为试材，通过不同质量浓度的激素组合成功诱导并获得体细胞胚，在8个月内都能成功获得再生苗。马盼盼等[30]以模式品种Coker312为对照研究新疆主栽陆地棉品种新陆早33号的体细胞胚胎发生和植株再生，新陆早33号在180 d 获得根系发育良好的再生幼苗，而 Coker312 完成这一过程则需要210 d。葛书娅等[31]利用(0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT)的激素组合成功建立了陆地棉新陆早45号的胚胎发生再生体系，150 d左右获得了再生植株。

根据国内早熟棉体细胞再生和早熟棉转基因研究现状文献报道，以及笔者对早熟棉体细胞胚胎发生和植株再生体系建立[24]所做的研究，总结出大田生产上广泛使用并能够进行体细胞再生的早熟棉品种有新陆早1号、4号、7号、12号、13号、17号、19号、22号、23号、32号、33号、45号，中棉所16号、24号，泗棉3号，晋棉5号，辽棉10号等；中早熟棉品种能够进行体细胞再生的有新陆中15号、20号、24号、中12、中13、中17、中19、中27、中35、中44、冀棉7、冀棉11、冀棉14、冀棉19、冀棉20、冀棉27、晋棉7、晋棉12、鲁棉1号、鲁棉2号、鲁棉6号、苏棉12号等。其中获得体细胞再生植株重复报道的有新陆早33号(7次)、新陆早1号(2次)、新陆早32号(2次)、泗棉3号(2次)。

2 国内早熟棉转基因研究进展

随着转基因棉花在国内大面积的种植，在早熟棉体细胞胚胎发生和植株再生研究的基础上，以早熟棉为受体的早熟棉转基因研究也开展起来。自王伟等[32]以新疆陆地棉栽培品种新陆早1号为转化受体，通过根农杆菌介导法成功地将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CPTI)基因导入新陆早1号并在7～8个月获得转基因再生植株后，有关早熟棉转基因的研究便一直备受相关科研人员的重视。吴慎杰等[33]以陆地棉泗棉3号的下胚轴为外植体，建立了高效的转化体系，得到了大量的转基因植株。中国农业科学院棉花研究所棉花生物学重点实验室以早熟棉中棉所24号为受体获得大量的转基因棉花，其中将拟南芥过表达基因AtCIPK23、AtAKT1和AtCBL1转入早熟棉中棉所24号中，张斌等[34]对转基因棉花苗期耐低钾的差异及机制进行了研究。孟颢光[35]利用根癌农杆菌介导法，将双价抗真菌病基因几丁质酶基因(Chitinase)和β-1，3-葡聚糖酶基因(Glucanase)导入中棉所 24 中，获得了抗性稳定的抗病植株；张兴华等[36]对转双价抗病基因(Chi+Glu)棉抗枯黄萎病竞争能力进行了研究；刘小玲等[37]对转RRM2和ACO2-E6基因棉花冠层特征和光合特性与产量形成的关系进行了分析；杨作仁[38]利用T-DNA 激活标签转化中棉所 24号所获得的pagoda1 突变体为研究对象，对棉花T-DNA激活标签突变体 pagoda1 的分子机制进行研究并应用。山西农业大学棉花研究所的李静等[39]为拓展可再生陆地棉的基因型，利用转基因技术直接改良已有的优良早熟棉品种，设置不同浓度的2，4-D和激动素(KT)4种组合进行诱导，用6～8个月成功获得体细胞胚和再生植株，构建早熟棉品种“中棉所16”再生体系，并利用该体系将EDT1抗旱耐盐基因成功导入“中棉所16”基因组，获得了转基因植株。利用早熟棉体细胞胚胎发生进行外源基因转化并获得成功的有新陆早1号、中棉所24号、泗棉3号、中棉所16号等4个棉花品种。中国农业科学院棉花研究所分子遗传改良实验室以中棉所24号作为早熟棉转基因受体的模式品种建立了规模化转基因技术体系，在早熟棉种质创制和功能基因验证方面发挥了重要的作用。但是目前还没有早熟棉直接作为受体转化选育的转基因早熟棉品种用于生产。

以上早熟棉品种经体细胞再生或作为转基因受体的重复验证均获得再生植株或转基因再生植株，可根据不同早熟棉种植区的需要选择作为转基因受体的优良品种。其他已报道具备体细胞再生的早熟棉和中早熟棉作为拓展早熟棉花再生基因型，经过体细胞再生试验、筛选高频再生品(种)系或株系可作为备用转化受体，这对于早熟棉花基因工程具有重要意义。

3 早熟棉转基因研究建议

农杆菌介导的早熟棉高效转化体系建立的关键是以高频(50%以上)体细胞胚胎发生和植株再生的优良早熟棉品种受体为基础，以高效的转化率(50%以上)为保障，为广泛高效的开展早熟棉转基因研究，创制生产上急需的早熟棉种质为目的。转基因早熟棉研究应将以下2点作为重点。

3.1 早熟棉高频再生纯合系的筛选以该研究阐述的能够体细胞再生且品质优良的(中)早熟棉品种为候选品种，如新陆早33号、新陆早32号、新陆早1号、新陆早45号、中棉所16号、中棉所24号、泗棉3号等，以这些品种的脱绒种子为材料，根据文献已报道的资料和笔者长期研究总结得出的结果[24，40]，调整早熟棉体细胞再生各阶段所需培养基组成成分，培养时间及继代次数，根据早熟棉生长发育特点调整组织培养条件。

参照吴家和等[41]的方法并做适当改进进行早熟棉高频再生纯合系筛选，将生长健壮的无菌苗(30株)分株进行下胚轴组织培养，选择不同单株10个克隆的可育再生单株，收获T0自交单铃种子。T0种子的无菌苗(T1)第2次组培，收获胚胎发生和再生周期短(150 d)的T0 株系的再生单株自交T1种子。种植T1种子，收获农艺性状优良的T2自交株行种子并扩繁，获得早熟棉高频再生纯合系转化亲本。高频再生纯合系转化亲本的获得可将转基因过程缩短到6～8个月，筛选流程如图1所示。

图1 早熟棉高频再生纯合系筛选流程

3.2 建立农杆菌介导的早熟棉高效转化体系根据已有研究与实践结果[42-43]，要建立早熟棉高效的转化体系必须以提高菌株活力降低转化材料的泛菌率和降低转基因棉花畸形苗和不育率为前提。

3.2.1提高菌株活力降低转化材料的泛菌率。分别挑取携带目的基因的农杆菌菌落接种于含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平LB液体培养基中，菌株活力旺盛的在28 ℃振荡培养24 h后OD600值可达到0.5～0.7，未达到此标准的菌株不能用作转化。农杆菌介导的棉花转基因体系要随时检测菌株的活力。将培养至对数生长期的农杆菌菌液用LB稀释100倍后加入50 mg/L的乙酰丁香酮(AS)，26～28 ℃振荡培养(180～200 r/min)0.5～1.0 h浸染棉花无菌苗下胚轴外植体切段8～10 min，浸染后吸干外植体上的菌液、低温共培(21 ℃)48 h。 经共培养后的下胚轴切段转入愈伤组织诱导筛选培养基中，在常规条件下[棉花遗传转化的组织培养条件均为：温度(28±2)℃，光照长度12 h/d，光照强度2 000 lx],先暗培养1个月，然后光培养1个月后再次转入诱导筛选培养基中，光培养1个月进行二次诱导筛选，愈伤组织直径达到0.5～1.0 cm，未诱导出愈伤组织的下胚轴切段淘汰。

通过浸染液的稀释、浸染后吸干外植体上的菌液、低温共培、暗培养和二次筛选，并严格继代操作规范等可将外植体及愈伤的泛菌现象降低到5%以下，菌株活力的增强可使转化率提高到50%以上。

3.2.2降低转基因棉花畸形苗和不育率。通过二次筛选诱导培养后将愈伤组织置入增殖培养基时即时抽掉激素；缩短胚性愈伤组织继代培养时间(10～15 d)至胚状体出现；分化的愈伤组织转入分化培养基M5时，用无菌透气封口膜封口、增加培养基固化剂含量(3.5 g/L Phytagel)，以改善分化愈伤组织的培养条件。采取胚状体培养时降低培养基中糖含量(25 g/L葡萄糖)，成苗培养基中改变固化剂和糖分含量(3.25 g/L Phytagel，20 g/L葡萄糖)等技术措施，可以降低棉花遗传转化过程中产生的畸形苗和玻璃化苗，使正常苗的产生率达到90%以上。将分化-见苗的组织培养时间控制在90～120 d，可使转化再生株的不育率降低到30%以下。获得再生植株并在嫁接前取试管苗叶片进行目标基因序列检测，嫁接阳性再生植株，这样可使转化过程缩短2～3个月，转化率提高到50%以上。

农杆菌介导的早熟棉高效转化体系建立的关键是以高频(50%以上)体细胞胚胎发生和植株再生的优良早熟棉品种受体为基础，该研究总结并部分验证出能够体细胞再生的早熟棉品种，从中遴选出作为早熟棉转基因受体的候选品种，其中新陆早33号经研究人员的验证，可作为新疆早熟棉转基因受体的优选品种，另外还有新陆早1号和新陆早32号；黄淮海棉区以中棉所24号、中棉所16号为早熟棉转基因受体的优选品种；长江流域棉区以泗棉3号为早熟棉转基因受体的优选品种。并结合吴家和等[41]的方法研究出高频再生纯合系的筛选技术，以农杆菌介导的中熟棉转基因体系为基础，对影响转化体系的各因子进行优化，研究出建立农杆菌介导的早熟棉高效转化体系的关键技术。以早熟棉高频再生纯合系种子为转化受体，利用高效的(转化率50%以上)农杆菌介导的转化体系将不同功能的目标基因直接转入早熟棉，将消除早熟棉杂交转育改良时花期不遇和改良后代生育期延长的现象，培育适宜新疆棉区、黄淮海棉区麦棉夏播套种、长江流域棉区麦和油菜后直播等一熟棉区以及轻简化种植所需的中早熟棉和早熟棉种质资源，可加快早熟棉转基因育种和基因功能分析的进程，提高棉花的综合利用价值。