阿拉善蒙古牛超数排卵及胚胎冷冻试验

孟克巴依尔，朱莉仙*，其其格，聂 慧，艾尔青萨仁高娃，乌力吉，朝克图

（1.阿拉善盟畜牧兽医技术推广中心，内蒙古 阿拉善 750300； 2.阿拉善左旗吉兰泰镇综合保障和技术推广中心，内蒙古 阿拉善 750333）

蒙古牛是我国北方优良牛种之一。蒙古牛具有乳、肉、役多种用途，适应性和抗逆性强，是我国珍贵的遗传资源。近年来，由于草原牧区家畜牛杂交改良，纯种蒙古牛数量和品质大幅下降。目前纯种蒙古牛主要分布在阿拉善盟，锡林郭勒盟和呼伦贝尔市有少量分布，其余地区已不复存在。蒙古牛数量的减少使品种内的遗传距离变得越来越窄，近亲繁殖已经不可避免，甚至出现退化现象，蒙古牛已经处于濒危维持状态，应当大力加强保护和发展。2021年4月阿拉善左旗绿森种牛场通过国家级保种场的现场验收。

目前，阿拉善蒙古牛保种最经济有效的方法是建立阿拉善蒙古牛的胚胎基因库，关键技术是胚胎冷冻保存，但有关阿拉善蒙古牛胚胎冷冻的相关研究鲜见报道。为了有效保护好阿拉善地方蒙古牛品种优质资源，我们尝试通过在阿拉善盟内选择优秀的蒙古牛公牛和母牛，采集精液，利用现代胚胎技术，通过供体母牛超数排卵、采集胚胎等一系列生物技术而达到生物基因保种的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供体牛的选择

在阿拉善盟内养殖蒙古牛的牧户家，选择阿拉善蒙古牛7头（编号200002，200004，200010，200016，200022，200024，200026）和2头优质成年种公牛（200001，200003）作为供体牛。选择的2头种公牛，年龄均超过4岁，体格健壮，性能力正常。所有供体牛体格健壮，无传染性疾病、生殖系统疾病等，经产母牛没有空胎史，繁殖机能正常。

1.1.2 实验药品与器材

（1）实验药品

黄体酮阴道缓释剂（CIDR），新西兰DEC进口，规格黄体酮1.38g；

垂体促卵泡素（FSH），国产宁波三生，规格500单位；

氯前列醇注射液（PG），国产上海计胜，规格2ml：0.2mg；

促黄体素释放激素A3，国产宁波第二激素厂，规格25μg/支；

冲胚液，美国ICP进口，规格1L；

保存液（Holding Solution），美国ICP进口，规格100ml；

冷冻液（乙二醇 1.5M），美国ICP进口，规格20ml；

盐酸利多卡因注射液，国产山东华鲁制药，规格5ml：0.1g。

（2）实验器材

显微镜，OLYMPUS；

胚胎冷冻仪，澳大利亚 CRYOLOGIC；

保定架、移植枪、灭菌塑料硬外套及软外套、三通导管、剪毛推子、冲胚器（50ml注射器）、集卵杯等。

1.2 方法

1.2.1 母牛干乳

供体母牛产犊后，7d后断乳，干乳，具体干乳时间见表1 。

表1 供体母牛干乳

1.2.2 超排处理

7头母牛超排处理使用CIDR+FSH+PG方法，见表2。

表2 母牛超排处理方法（FSH是7头母牛平均超排注射量）

1.2.3 母牛人工授精

母牛与公牛采取隔离状态，观察确定母牛的发情时间。选择200001号种公牛人工授精。采用电刺激法采集精液，精液采集完镜检合格后装0.5ml细管7支，避光。一般情况下，每隔12h授精一次，每次输精一支，共授精3次。

1.2.4 胚胎采集

供体母牛受精日计0d，输精第7d采集胚胎，冲胚之前，所用的仪器、器皿等经过严格的消毒灭菌处理，采用二路冲卵管法进行非手术冲卵。

首先将牛保定，用2%的利多卡因实行尾椎硬膜外麻醉，利多卡因用量5～10ml，直至尾部无知觉。麻醉后将牛尾固定，清除粪便，清洗、消毒会阴部及外阴。

用扩宫棒扩张子宫颈，然后插入宫颈粘液器将粘液抽出，随后把带刚芯的冲卵管慢慢插入阴门，达到子宫角前端。冲卵管先冲一定气量10～20ml，最后抽出内芯。

连接冲胚和三通导管。用50ml注射器吸取冲胚液从输入管注入子宫角，然后吸回，一般情况下一侧子宫角需冲6～8次，用300～400ml冲胚液。冲卵完成后，将气囊空气放出，冲卵管抽至子宫体，灌注青霉素、链霉素药物预防子宫炎。

1.2.5 胚胎处理及冷冻保存

胚胎处理：将回收液缓慢倒入集卵杯内，用带针头的一次性注射器抽取冲胚液，冲洗集卵杯滤网3～4次，最后保留10ml左右液体倒入Ф100mm培养皿中，进行镜检。划分区域检查、避免遗漏。用移液器将检出胚胎移至盛有保存液的Ф35mm培养皿中。同一供体牛的胚胎放于同一培养皿液滴中，然后用移液器先吸入少量第二滴保存液到第一液滴，吸入全部胚胎，防止吸入黏液、杂质，移至第二滴中，一次冲洗胚6～8次。

胚胎装管：即五段液体、四个气泡。细管塞上需记录好胚胎明细：供体牛号、胚胎数量、质量、日期等。装管后平衡10min左右。

胚胎冷冻：先将冷冻室内加少许液氮预冷，预冷后加入足量液氮，将装有胚胎的细管放入冷冻室，至制冰温度时，平衡，进行植冰，70min后，将胚胎细管投入液氮保存。

2 结果

2.1 超排效果

选择7头阿拉善蒙古牛母牛进行超排，共采卵7头次，采集卵数12枚，其中4枚可用胚胎，具体见表3。

表3 阿拉善蒙古牛母牛超排效果

2.2 胚胎形态学

3头供体母牛的胚胎形态如图1，经鉴定，胚胎等级见表2。

图1 供体母牛胚胎形态

3 讨论

3.1 影响超排效果可能的因素

影响超数排卵效果因素很多[1]。供体牛的营养情况也是影响超排反应的一种重要因素，因为营养状态优良的供体牛，其卵巢功能好，排卵多，而营养状态较差的牛排卵较少影响超排反应[2]。Prakash 等[3]研究表明，供体体况对于超排反应具有重要的影响，体况差的牛导致并加剧黄体的早期退化（发情后 6～8 h），严重影响超排效果，退化严重时，甚至无法得到胚胎。

研究表明，季节和环境的变化会显著影响超排效果[4]。即使在同一季节、气候条件、营养水平不同，动物的感受刺激也不尽相同，它们影响动物的超排效果[4]。一般的说，严寒、酷热均对家畜造成应激，这些极端刺激对生理的不良影响会作用于生殖内分泌轴，继而影响到发情和排卵[5]。

在生产实践中，如用经产母牛作为供体，一定要严格选择并了解经产牛的产犊历史、胎衣排出情况及产犊时间，同时了解经产牛的胎次及年龄，调整FSH的剂量，这在超排实践中非常重要[6]。实践证明，产犊后3个月的母牛超排才能达到理想的效果[6]。

与吴柱月等报道[7]：“（包括西门塔尔、短角牛、Lowlone 牛）的超排效果：头均可用胚胎数：青年牛为5.9～7.2枚，经产牛为5.8～7.5枚，”相比之下，阿拉善蒙古牛的超排效果很差，这是否与蒙古牛品种有关还是使用的药品原因？以及种公牛人工授精的效果有差异？阿拉善蒙古牛母牛的超排尚未见有报道。牛的超数排卵是一个复杂的生理过程，受很多因素的影响：包括品种、生物学特性、年龄、季节、时间、FSH品牌及剂量、卵巢状态、超排方法及饲养管理水平等等因素的影响[8]。阿拉善蒙古牛的超排效果是否就是现在试验的效果，有待进一步的实验研究。