毒死蜱的免疫分析专利概况

陈翠翠，梁艳辉

(国家知识产权局专利局专利审查协作江苏中心，江苏苏州 215163)

毒死蜱(chlorpyrifos)是美国陶氏公司于1965年开始推广使用的一种高效有机磷类杀虫剂，主要用于粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫防治。毒死蜱广泛地应用于农业生产，为农业生产提供保障，但其也存在缺点，即其对鱼、虾等水生生物毒性高，其中鱼类LC50(96 h)为0.001 3 mg/L，水生甲壳类动物LC50(96 h)为0.000 04 mg/L。此外，毒死蜱在自然环境中的半衰期较长，其在水中的降解半衰期为27～158 d，在土壤中的半衰期为10～120 d。毒死蜱也容易在农作物和蔬菜中残留，从而对人体造成损害，如人体急性毒死蜱中毒可引起头痛、多汗、恶心、头晕眼花、呼吸困难、心率减慢等症状，长期或反复接触毒死蜱可引起麻木、刺痛等中枢神经系统症状，高剂量可导致昏迷死亡。对毒死蜱越来越 多的研究表明，其对发育期的中枢神经系统存在慢性毒性作用。流行病学研究表明，毒死蜱的暴露与儿童注意多动缺陷障碍、记忆力减退、认知障碍等相关，而且还影响胎儿的体格发育[1]。

由于毒死蜱对儿童的神经毒性，为保护儿童健康，各国对毒死蜱实行了严格的禁限用措施。2000年6月，美国国家环境保护局宣布基于毒死蜱会危害到儿童的健康安全，禁止在美国家庭和庭院内使用该杀虫剂，并于2015年提议在美国全面禁用毒死蜱。2013年，我国农业部第2032号公告指出，自2016年12月31日起，全面禁止毒死蜱在蔬菜上的使用[1]。

为了保证食品的安全性，许多国家规定了食物中各种农药残留的限定量(MRL)，其中，我国《食品安全国家标准：食品中农药最大残留限量》(GB 2763—2021)规定毒死蜱的最高残留量为：谷物如稻谷和小麦0.5 mg/kg、玉米0.05 mg/kg、绿豆0.7 mg/kg、小麦粉0.1 mg/kg；油料和油脂如棉籽油0.05 mg/kg、大豆油0.03 mg/kg、玉米油0.2 mg/kg等；蔬菜如叶菜类0.02 mg/kg、芹菜和芦笋0.05 mg/kg、食荚豌豆0.01 mg/kg等；水果如草莓0.3 mg/kg、葡萄和李子0.5 mg/kg、柑橘和苹果、梨、山楂、枇杷等1 mg/kg、橙和柚2 mg/kg、桃和杏3 mg/kg等，相比之前的国家残留标准均有进一步的细化和残留量的降低，即标准要求提高。

农药残留分析是保证食品、环境安全的必要手段，其已成为世界各国农药管理中的必要环节。毒死蜱的环境毒性和健康危害以及我国对毒死蜱农药的限制使用，体现了对毒死蜱农药进行残留分析的必要性和重要性。

农药残留检测的传统方法有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS)或液相色谱-串联质谱法(LC-MS)等，具有使用范围广、分离效能高、灵敏度高、重复性好、选择性强、可同时进行多残留分析且定性定量准确等优点，已成为农药残留检测不可或缺的常规手段。但是，上述检测方法所需要的仪器设备昂贵且庞大、笨重，样品制备比较复杂、成本高，需要熟练专业技术人员操作，只能在实验室内进行抽样检测，难以满足样品现场快速检测的要求[2]。

免疫分析技术是利用抗原(或半抗原)与抗体特异性结合而建立的高选择性生物化学方法[3]，其作为一种操作简单、快速、灵敏度高且经济的检测技术，近年来在农药残留分析方面的应用飞速发展。相比较于仪器检测，免疫分析在农药残留检测中，具有高度专一性和特异性、简单快速、灵敏度高、性价比较佳等优点，可实现农药残留的现场快速检测[4]。本文着重阐述了毒死蜱残留检测中的免疫分析技术的专利概况，以期为毒死蜱残留检测的进一步研发提供参考。

1 申请人、申请量、法律状态分析

从申请年度和申请量来看，发明点涉及毒死蜱半抗原、抗体以及免疫分析技术的发明专利总量约150件，且申请主要集中在2014年以后，但每年的申请量也未超过20件。可见，研发热度不是很高，当然也有一部分新技术发表于期刊中，并未申请专利。其中，授权专利量为73件(其中目前授权有效专利量为53件，14件未缴年费，6件有效期满)、失效量(撤回和驳回)为48件，实审中专利量为28件、公开1件。虽然申请量不大，但是该领域的授权量较大，技术创新性高。

另外，在全球申请人中，国内申请人约占88%，绝大多数为高校和科研院所，其中申请较多的申请人包括山东理工大学、浙江大学、华南农业大学、江南大学、江苏大学、江苏省农业科学院、济南大学、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究 所、华中农业大学、合肥学院等。国内的企业申请人主要有北京勤邦生物技术有限公司、江苏美正生物科技有限公司、苏州快捷康生物技术有限公司等，其申请量较少，多数仅有1件。国外申请人主要有印度阿米提大学(Amity University)、美国OHMICRON技术公司或美国陶氏益农(Dow Elanco)等。由此可见，免疫分析技术以及其半抗原或抗体的制备技术主要掌握在各研究主体单位如高校和科研院所中，仍处于基础研发阶段，成熟的、商业化的免疫检测试剂盒、试纸等产品较少。

2 毒死蜱的半抗原、人工抗原及抗体

毒死蜱属于(C2H5O)2P(X)Y结构的有机磷类农药，其中，X代表O或者S，Y代表其他化学基团或结构。毒死蜱为非蛋白的小分子物质(分子质量＜1 000 Da)，本身没有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体，必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，与大分子载体如蛋白质等连接构成有效人工抗原。建立毒死蜱免疫检测方法的关键步骤是半抗原的设计与合成[5]。半抗原分子通常包括2部分：毒死蜱分子的部分或全部结构与间隔臂。以此成功制备人工抗原及其特异性抗体。

2.1 特异性半抗原、人工抗原

浙江大学的朱国念等(CN1179966C)设计了一种毒死蜱人工半抗原，在毒死蜱分子的2个不同位点引入连接臂，合成毒死蜱的半抗原a或b；设计的最适半抗原制备的人工抗原为c或d (图1)。以此人工抗原为免疫原制备获得具有特异性识别的抗体，用于快速准确分析食品、植物和环境土壤与水等样品中毒死蜱的残留量。这种方法灵敏度高，特异性强，样品前处理简单，检测费用低，便于进行现场监控，最低检测限为5 μg/L。

随后，浙江大学(CN10680405A)还设计了另一种毒死蜱人工半抗原，将毒死蜱分子结构中的-OC2H5通过化学合成改造成-NH(CH2)nCOOH，最大程度保留了毒死蜱的化学结构，又具有可调节长度的连接臂，同时还具有可以与蛋白质偶联的-COOH，如图1的化合物e。与CN1179966C相比，该法的最低检测限大幅度降低，仅为0.4 μg/L，灵敏度明显提高。

2.2 通用半抗原及通用抗体

有机磷农药多残留免疫检测是针对一类农药同系物的共性结构来设计和合成通用半抗原，从而制备得到对于特定的一类(或其中几种)化合物都具有识别和检测能力的通用结构抗体，即具有广谱特异性的抗体。此法能通过一次试验同时检测多种农药残留量，具有高效、快速等优点。

目前采用免疫分析方法进行多残留检测常有2种方法。一种是采用一类药物的共有结构作为免疫半抗原，获得对同类农药具有特异性识别反应的广谱抗体。如英国农渔业和食品部(Minister of Agriculture Fisheries and Food UK)(GB2293384B)设计了一类有机磷农药的通用型半抗原：(RO)2-P(S)-Z-(Y)-B-(D)，其中R为低级烷基，Z是O、S或-NH-，Y是间隔臂，优选具有-(CH2)n结构的间隔臂(n=4～6)，B是-CO-或-O-CO，D是H或能够增强化合物与蛋白质之间反应的活化剂基团。

韩国李元泰(LEE YONG-TAE)等(US7098341B2)设计了硫代磷酸酯类杀虫剂的通用型半抗原的制备方法，如图2所示。先将酚类化合物与二氯硫代磷酸O-甲基(乙基)酯反应生成O-芳基氯硫代磷酸-O-甲基(乙基)酯，再将后者与氨基羧酸反应，获得用于有机磷硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原。此法可用于甲基对硫磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、倍硫磷、杀螟硫磷等硫代磷酸酯类杀虫剂的免疫分析。

华南农业大学(CN101463086B)在二乙氧基硫代磷酸酯结构的苯基的4位上引入丙烯酸活性手臂，制备免疫半抗原，半抗原偶联BSA制备免疫原，免疫原免疫新西兰大白兔制备得到所述有机磷农药多克隆抗体；所述抗体与作为酶联免疫检测中的包被原建立有机磷农药多残留ELISA检测。所述免疫半抗原结构为化合物f，免疫抗原为化合物g，包被原为化合物h (图3)。该多克隆抗体具有广谱特异性，能同时检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药12种以上，检测限为0.000 2～3.393 8 μg/mL，可高通量快速筛选样品，检测成本远低于传统方法，而且稳定性和重复性好。

另一种是采用将多个农药的半抗原偶联到载体蛋白上制备成人工抗原，经过动物免疫获得对目标农药有特异性识别的“宽谱特异性抗体”。如浙江大学(CN1908664B)设计了一种多簇抗原、宽谱特异性多克隆抗体，可用来同时检测三唑磷、毒死蜱和克百威。该多克隆抗体能用于快速、简便地同时检测出样品中多种相同或不同结构类别的残留小分子化合物，为免疫分析的抗原和抗体的制备提供了全新的思路。浙江工商大学(CN103044553A)将抗三唑磷的杂交瘤细胞株和抗毒死蜱的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体。该技术从抗体的结构和特性入手，通过杂交-杂交瘤技术获得能特异性识别2种同类药物，甚至是结构差异大的2类药物的双特异性单克隆抗体，与传统的抗体快速检测相比具有质的飞跃，在探索药物多残留快速检测技术新的研究领域和发展方向方面具有重要意义。

随着人们对抗体基因结构与功能的深入了解和分子生物学技术的发展及多学科的交叉渗透，小分子有害物的特异性抗体制备正在朝着第3代抗体——基因工程抗体的方向发展。华南农业大学(CN107056946A)基于第3代抗体——基因工程抗体技术提出了一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab (即为抗原结合片段)抗体，用于检测含有二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药(DPPS)，如对硫磷、辛硫磷、毒死蜱等。抗DPPS的可溶性Fab抗体与抗原的结合可被游离的半抗原竞争性抑制，IC50为135.7 ng/mL，具有很好的抗原结合活性，比亲本单克隆抗体(monoclonal antibody，Mab)的亲和力提高1.4～2.8倍。该方法可实施大量样品的快速检测筛选，具有较高稳定性和灵敏度，可通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中很经济地大规模生产，避免单克隆细胞阳性丢失风险。

3 毒死蜱的免疫分析技术

免疫分析技术是目前农药残留检测的有效方法之一，基于抗体的特异性识别作用，采用不同的标记体系和检测体系进行信号的传递与检测，赋予了免疫分析技术多样化的特点，主要包括酶联免疫分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析、SERS标记免疫分析、免疫层析技术、免疫芯片、生物条形码免疫分析法和免疫传感器等，各方法在应用中显示出不同的分析特点。以下就发明专利中涉及毒死蜱的主要免疫分析技术进行介绍。

3.1 酶联免疫分析

酶联免疫分析(ELISA)是经典免疫分析技术，也是用于农药残留检测的最主要的免疫分析手段之一。ELISA的原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，受检样品与固相载体表面的抗原或抗体反应形成复合物，再加入酶标记的抗原或抗体。此时固相载体上的酶量与样品中受检物质的量成一定比例。加入与酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度(OD)值即可进行定性或定量分析[6]。如北京勤邦生物技术有限公司(CN106324240B)采用间接竞争酶联免疫法获得了检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒，其采用的毒死蜱半抗原是化合物i (图4)。

为了减少ELISA检测的缺点，如抗体的不稳定性等，华南农业大学(CN101241135B)采用毒死蜱抗体经与抗体反应被吸附于固相载体上的间接竞争酶联免疫吸附分析技术，制备了检测农药毒死蜱残留的酶联免疫试剂盒。所述酶联免疫试剂盒采用第二抗体预包被酶标板，节约了毒死蜱抗体的用量，而且克服了直接包被第一抗体不利于试剂盒长期保存的问题。同时，大幅度提高了试剂盒的检测灵敏度与精密度，对毒死蜱线性检测范围为0.000 1～1 mg/L，最低检测限为0.1 ng/mL，成本低，适用于农药毒死蜱残留现场监控的痕量分析。

3.2 荧光免疫分析

荧光免疫分析(FIA)技术是将不同的荧光素作为标记物修饰在抗原、抗体上进行分析检测。如华南农业大学(CN102206485A)提供了一种基于荧光偏振的有机磷农药均相多残留免疫检测方法，其采用的荧光素标记物为化合物j、k、l (图5)。所述有机磷农药均相多残留免疫检测方法具有方法简便、样品前处理简单、一步反应、无需洗涤分离，时间短，操作方便，可用微孔板进行大量样品检测，可以同时测定20种有机磷农药，对毒死蜱的最低检出限为211.45 ng/mL。

生物抗体由于其自身的易失活、不易保存等缺陷，实际应用状况不甚理想，为了解决生物抗体存在的问题，仿生抗体作为生物抗体的替代技术应运而生。山东农业大学(CN108918859B)以多识别位点Fe3O4@SiO2@MIP为公共仿生抗体，用3种同一激发波长下的不同发射波长的量子点分别标记甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫3种有机磷农药半抗原，建立简便、快速的仿生荧光免疫分析方法，可以同时检测甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫3种有机磷农药。这种仿生抗体可以克服生物抗体制备周期长、保存不当易失活等问题，建立的仿生免疫吸附检测技术，可用于检测农产品及食品中的农药残留，是国内外研究的热点。

3.3 化学发光免疫分析

化学发光免疫分析(CLISA)是继放射性免疫分析、酶免疫分析和荧光免疫分析之后发展起来的一项高敏感免疫分析技术。CLISA是将免疫分析的特异性与化学发光的高灵敏性相结合的一项技术。该技术采用发光剂或催化剂等化学发光试剂标记抗原或抗体，在进行免疫分析时，通过测定化学发光强度来进行待测物的定量分析。

华中农业大学(CN102053155A)以鲁米诺-牛血清白蛋白-毒死蜱为化学发光标记物，构建了一种检测毒死蜱的均相化学发光免疫分析方法(即为化学发光标记免疫分析)。该方法操作简单、快速、成本低，在蛋白载体上标记了化学发光剂鲁米诺和目标待测物质毒死蜱，能够放大响应信号，增加了体系的灵敏度，可以实现快速定性和定量的分析检测。该方法对毒死蜱的检测限为1.27 ng/mL。但该方法还存在一些缺陷，如检测准确性低、稳定性不佳、无酶的信号放大作用。针对上述问题，该申请人 (CN112904003A)以辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等为催化剂，以鲁米诺(luminol)、吖啶酯或3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD)为发光底物，构建了一种酶促均相化学发光生物检测方法，即为化学发光酶免疫分析方法。该方法可用于样品中毒死蜱的定量分析。该方法提高了检测的准确性、灵敏度，并且无需任何洗涤、分离操作，同时提高了检测速度，降低了成本，适用性很广。

虽然化学发光免疫分析技术在有机磷农残检测中取得了重大突破，但是生物识别敏感材料如抗体、酶、特异蛋白和DNA等生物分子性质不稳定，受环境影响大，价格极为昂贵。因此，使用生物敏感材料制作的化学/生物传感器比较脆弱，使用寿命短，在苛刻条件下可能失去敏感特性，这严重阻碍了化学/生物传感器的发展和普及。近来，使用分子印记材料代替生物材料作为识别元件的化学传感器取得一些进展。如皖西学院(CN102253201A)以功能化双键修饰的SiO2为核，在其表面印记毒死蜱分子，然后洗脱毒死蜱，获得毒死蜱分子印记空心粒子，构建了基于表面印记空心粒子的化学发光免疫传感器。毒死蜱分子印记空心粒子与传统的分子印记聚合物相比较，具有较多的表面识别位点，较大的结合量和快速结合动力学。测定毒死蜱的检测限为0.92 nmol/L，具有较高的灵敏度。

3.4 SERS标记免疫分析

表面增强拉曼光谱(SERS)是在拉普光谱的基础上发展的一种振动光谱技术，其灵敏度可降至单个分子水平，提供精细的分子指纹，可以直接识别目标分析物。由于其具有操作简单、检测速度快等优点，被广泛应用于药物分析、生物分析、环境污染物等领域的检测。近年来，SERS在农药残留的现场快速实时检测方面凸显了很大的应用价值。

SERS标记免疫分析技术是现代生物标记技术与SERS光谱方法相结合而发展起来的一种新型SERS检测方法。这种方法实现了生物分析技术、纳米技术与SERS检测技术3者的有机结合，其原理是基底上的固相抗体、标记抗体与抗原结合形成“固相抗体-待测抗原-标记抗体”夹心复合物，利用金、银等贵金属纳米粒子的增强作用建立基于免疫竞争的高灵敏检测技术。

欧普图斯(苏州)光学纳米科技有限公司(CN103698510A)将SERS光谱方法和免疫技术、纳米标记技术相结合，提供了一种可以识别有机磷类农药的方法，其原理如图6所示。

SERS基底是实现目标分子特异性吸附的重要材料，研究适用于SERS基底材料以提高灵敏度和稳定性尤为重要。东南大学(CN110376179B)将SERS技术和分子印迹纳米纤维基底材料相结合，通过电纺技术制备了用于SERS检测的分子印迹纳米纤维增强基底膜，应用于表面增强拉曼光谱实现了基底膜的特异性识别，并提高了基底膜的吸附容量，从而提高对有机磷农药如毒死蜱的检测灵敏度。中国地质大学(CN111208113B)基于PVDF-hfp/rGO-PEI柔性复合压电薄膜负载纳米Ag型自供能SERS基底是将表面增强拉曼技术与柔性发电复合多孔薄膜相结合，实现了电压促进SERS基底的一体化。所得自供能SERS基底有较好的发电和保压性能，利用电场来提高农药检测的灵敏度，应用更加广泛，可以有效地检测微量农药如毒死蜱的残留。

近年来，SERS免疫标记分析技术逐渐成为生物检测方向的一个研究热点，但是该技术还处于起步阶段，存在不少亟需解决的问题。如在农药多残留检测中，需要进一步发展SERS的多组分标记技术，筛选合适的不同拉曼特征信号标记分子，制备高灵敏多组分标记探针，需要克服传统免疫夹心法对小分子物质结合活性位点少而导致检测灵敏度低等技术缺陷。针对上述缺陷，中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所(CN109187490B)以分子印迹技术与拉曼信号放大探针技术联用，通过合成多种SERS信号标记分子，采用共价键、静电自组装等重构技术分别制备了基于金属纳米球/载体蛋白/目标物构成的3种不同信号标记探针，实现了SERS信号放大检测多组分农药的快速检测。构建的基于SERS技术的农药检测试剂盒可以检测莠去津、毒死蜱、三唑酮中的一种或多种，对毒死蜱的最低检出限为0.10 μg/L，大大低于最高残留限量值，拓展了农药多残留快速检测技术的新方法和新途径。

3.5 免疫层析技术

免疫层析(IC)技术是20世纪80年代兴起的一种检测技术，它将抗原与抗体的特异性与层析技术集于一体，其原理简图如图7所示。免疫层析技术相对于其他的检测方法而言，更加适用于现场检测和大批量样本的筛选。

根据使用的标记物不同可将免疫层析技术分为胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、量子点层析技术、荧光微球层析技术、时间分辨荧光免疫层析技术、磁珠免疫层析技术、适配体层析技术，统称为免疫试纸条技术(IST)[4]。

江苏省农业科学院(CN104262486B)提出了检测甲基毒死蜱的免疫层析试纸条，其以硝酸纤维素膜为检测垫，以纳米金标记的保藏编号为CCTCC NO: C2014106的杂交瘤细胞株FQ-2G3分泌产生的单克隆抗体喷涂金标垫。用该单克隆抗体研制的免疫层析试纸条可实现水、青菜和土壤中甲基毒死蜱的检测，抗体稳定性高，对检测溶液中甲基毒死蜱含量的最低检测限可达12.5 ng/mL。

根据使用的标记物不同还可以制备出不同类型的免疫层析试纸条，如江苏美正生物科技有限公司(CN106970217B)提供了一种指示剂可以为荧光染料或纳米颗粒(如胶体金、量子点、磁纳米颗粒、时间分辨荧光微球、彩色乳胶微球、荧光乳胶微球或上转换荧光纳米颗粒)的定量检测有机磷类农药(如毒死蜱等)的免疫层析方法，可以制备出不同类别的免疫层析试纸。该方法还使用电鳗乙酰胆碱酯酶代替有机磷农药抗体，制备的抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体对抗原具有更强的结合能力，可以增强指示剂在检测线位置的固定效果，检测灵敏度高，检测目标物种类多，实现准确、快速、现场高通量的检测需求。

3.6 免疫芯片

免疫芯片，也称抗体芯片或抗体微阵列，是最重要的蛋白质芯片，也是一种全新概念的生物芯片检测技术，它将抗原抗体反应的特异性与电子芯片高密度集成原理相结合而建立，为高通量获取生物 信息的检测方法[7]。

抗体芯片技术主要采用微阵列点样法将抗原抗体固定于玻片、硅胶板或多孔板上，使其高度集成，然后进行免疫反应。该技术在农药残留检测中的应用最为广泛。相比于传统免疫分析方法，免疫芯片的主要优势在于多组分同时分析和灵活便携，且样品用量少。如徐州工程学院(CN103439514B)构建了基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，将农兽药如毒死蜱的单克隆抗体制备捕获单抗探针的微阵列芯片，以荧光分子Cy3标记检测抗原，然后进行免疫反应。该技术将酶联免疫技术和生物芯片微点样技术相结合，具有高通量，特异性强，检测的可控性和可靠性远高于ELISA等其他常规检测方法的特点。深圳市罗湖区人民医院(CN113281309B)将SPR技术和免疫芯片技术相结合构建了SPR免疫芯片，可同时实现定量检测毒死蜱、多菌灵、莠去津3种农药的残留浓度，检测效率高，对毒死蜱的检测限为5.14 μg/kg。

3.7 生物条形码免疫分析

生物条形码免疫分析法是将生物条形码技术和免疫分析法相结合的一种具有超高灵敏度检测的快速高通量筛选方法，是一类新型的核酸信号放大检测技术，可用于核酸和蛋白质的检测，具有较高的灵敏度和特异性。该方法最早是由Mirkin等在2003年提出，2016年中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所首次将生物条形码技术结合免疫分析技术用于检测小分子物质——农药三唑磷，条形码结合微孔板用于信号放大，定量限达1.96×10-2ng/mL[8]。随后该申请人将生物条形码免疫分析技术应用到其他农药残留检测中，如中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所(CN108931649A)将用荧光基团标记的生物条形码、特异性单克隆抗体的金纳米粒子相结合制备获得了基于荧光寡核苷酸信号放大技术检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒。该申请人(CN113567658A)还将催化发夹自组装技术与生物条形码免疫分析相结合，构建了一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒，试验结果表明，在0.01～50 ng/mL的线性范围，三唑磷、对硫磷、毒死蜱LOD值(IC10)分别为0.012、0.0057、0.0074 ng/mL，具有较高的灵敏度和准确性。

3.8 免疫传感器

免疫传感器是利用抗体能识别抗原并与抗原结合的功能生物传感器。它利用固定化抗体(或抗原)膜与相应的抗原(或抗体)的特异反应，使生物敏感膜的电位发生变化。免疫传感器的基本原理是免疫反应，是利用抗体对相应的抗原的识别和结合的双重功能，将抗体或抗原与转换器组合而成的检测装置[9～10]。

江苏大学(CN103630587B)提供了一种快速、灵敏检测有机磷农药毒死蜱的光电化学免疫传感器，将光电化学与酶传感偶合技术相结合，以Cd0.5Zm0.5S-r-GO纳米复合和乙酰胆碱酯酶修饰玻碳电极表面，基于Cd0.5Zm0.5S-r-GO良好的光电化学性能及生物相容性，构建光电化学传感界面应用于有机磷农药的快速灵敏检测。对毒死蜱的检出限可达0.3 ng/mL。

电化学免疫传感器是有机磷农药残留专利申请中研究较多的技术，如CN10400715B、CN104034777B、CN105092850B、CN106370708B、CN106525949B、CN109100406B、CN110455898B、CN110487868B、CN110579522B、CN110632142B等。

山东理工大学(CN102608187B)采用壳聚糖、空壳纳米金和L-半光氨酸对玻碳电极进行修饰，用乙酰胆碱酯酶作为检测有机磷农药的分子识别元件，制备了电流型乙酰胆碱酶生物传感器，具有检测限低，范围广，精度高，适用于现场检测等优点。该 申请人(CN103115949B)还提供了另一种检测农药残留(如毒死蜱)的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器，以多壁碳(MWNTs)-壳聚糖(CHIT)复合物和纳米金胶(AuNPs)作为载体材料修饰玻碳电极(GCE)，并利用层层自组装方法固定多层聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)和乙酰胆碱酯酶(AChE)，得到(PDDA- AChE)3/AuNPs/MWCNTs-CHIT/GCE传感器。该传感器提高了乙酰胆碱酯酶的固定量，提高了生物传感器的稳定性。

南昌大学(CN103424381B)提出了基于磁性分子印迹聚合物放大效应构建的表面等离子体共振(SPR)传感器，与传统的农残检测技术相比，该技术对毒死蜱的检测灵敏度高，选择性好，具有很好的应用前景。

扬州工业职业技术学院(CN109959684B)基于纳米钙钛矿材料的酶-分子印迹双识别型毒死蜱传感器，即MIP/ITO/CH3NH3PbI3/CS/AChE双识别型传感器，对毒死蜱的选择性好。

浙江大学(CN103558178B)构建了太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，利用已固定毒死蜱与未固定毒死蜱的检测点的太赫兹时域波谱差异来检测毒死蜱。因太赫兹波对大分子(DNA、蛋白质)敏感，故该方法准确性高。该方法能够同时检测多点，检测效率高，用时短，能满足日益增长的快速检测需求。

武汉市农业科学院(CN111007252A)构建了一种基于生物正交反应改变纳米磁颗粒数量及状态，进而检测农药残留的生物传感方法。该方法基于二苯基环辛炔与叠氮的级联生物正交反应，同时改变磁纳米颗粒的数量和聚集状态，实现了磁纳米颗粒数量和状态的可控调节，2者有机结合进行磁信号级联放大，最终实现对样品中农药残留的高灵敏检测。MNPs (磁纳米颗粒)数量变化引起的信号放大与 MPs状态变化引起的信号放大的有机结合，实现级联信号放大，是该传感器能够实现超灵敏检测的核心技术。该检测方法检测速度快、成本低。

华中农业大学(CN110470688B)构建了一个对Cu2+具有很高亲和力的纳米鳌合筛，结合免疫磁富集和低场核磁共振技术，进而构建了一种纳米螯合筛介导的低场核磁共振免疫传感器，并且用于农兽药(如毒死蜱等)残留和生物大分子的检测。相比于传统的低场核磁免疫传感器，具有更高的灵敏度、稳定性和特异性。

适配体的识别特性与抗体相似，又称“化学抗体”。与抗体相比，适配体是由体外筛选和扩增获得，不需要免疫动物或培养细胞，具有极好的准确性和重复性，很高的纯度，可以避免产生批次间差异等优势。如山东理工大学(CN105301077A)提出了一种检测毒死蜱的适配体传感器，适配体传感器的敏感界面组成包括介孔碳-壳聚糖复合物和二茂铁-多壁碳复合物，进而固定毒死蜱的适配体。此外，CN110186912B、CN110441369B等也构建了毒死蜱的电化学适配体传感器。

4 总结与展望

4.1 半抗原与抗体的设计

在免疫分析中，半抗原及抗体的制备是免疫分析方法的关键步骤，半抗原结构特异性越强，抗体的灵敏度就越高，而有机磷通用型半抗原制备的抗体检测谱广。但是，分子结构太小会导致抗原表位不能被机体有效识别，抗体灵敏度差，达不到残留检测的要求。因此，在农药多残留检测中，应综合通用半抗原与特异性半抗原的复合免疫，扬长避短。

从抗体性质和特性来看，多克隆抗体虽然能检测多种农药，但是多克隆抗体不能再生，可能存在精确度不高、稳定性差的缺陷。如上文所述，生物抗体自带不稳定缺陷，而且，农药抗体制作难度大，可能会出现假阳性或假阴性现象。为了克服其缺陷，首先可以借助基因工程技术制备单克隆抗体，或者采用适配体技术，不仅能很经济地大批量生产，还不存在批次间差异。其次可以寻找能够替代与毒死蜱结合的抗体，例如上述专利中提到的抗电鳗乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体等。此外还可以通过设计非生物抗体-仿生抗体来解决生物抗体制备周期长、保存不当易失活等问题。

4.2 免疫分析方法的存在问题与展望

免疫分析方法具有特异性强、灵敏度高、方便快速、高通量、检测成本低、安全可靠等特点。该方法一般不需要贵重仪器，对使用人员技术要求不高，容易普及和推广，尤其适合现场筛选和大量样品的快速分析。但是不同的免疫分析技术也存在差异，如酶联免疫分析法的样品处理难、前处理步骤多，会存在较大的误差，一般用于半定量或定性分析。免疫层析试纸条技术操作简单快速，但准确性和灵敏度偏低，也多用于半定量或定性分析。

免疫技术与荧光、电化学、基因工程、微阵列芯片、生物条形码等新技术的结合，使得检测灵敏度大大提高，多数免疫分析方法都可以达到半定量以及定量分析要求。电化学生物免疫传感器、SPR传感器等不需要标记物即可进行高灵敏的快速检测，是目前研究的热点。但是，免疫技术和新技术的结合方法中也存在一定的问题，如稳定性差，成本高，样品复杂的基质干扰，发光剂的选择和制备，免疫芯片的集成和制备，SPR传感器的制备，大量抗体的消耗等问题，这也是新型免疫分析技术的研究动力。在追求更高的灵敏度和便携性的同时，降低研究和制备成本、降低基质抗干扰性，仍然是目前的发展要求。生物条形码免疫分析是近几年发展起来的农药残留分析方法，免疫技术结合新型的核酸信号放大检测技术，使得该方法具有超高灵敏度、特异性和快速高通量筛选的优点，具有较好的发展前景。

在专利分析中发现，新型免疫分析技术一般集中在高校或科研院所中，这也间接说明了新型的免疫分析技术对专业技术要求较高，在农药残留检测的实际应用中仍然较少，这也进一步提示了新型免疫分析技术应当符合在实际应用中的要求。因此，随着免疫技术与其他技术的不断结合和发展，检测分析技术将会朝着绿色、快速、多残留、高灵敏、低成本和商品化的方向发展，将会在农药残留检测中发挥着越来越重要的作用。