NLRP3炎性小体在非嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及临床意义

李想，尼玛吉宗，巴罗，钟兵，徐小东，谢立锋,4，杜进涛

(1.西藏大学，西藏 拉萨 850000; 2.西藏自治区人民医院 耳鼻咽喉科，西藏 拉萨 850099; 3.四川大学华西医院 耳鼻咽喉头颈外科，四川 成都 610041；4.北京大学第三医院 耳鼻咽喉头颈外科，北京 100191)

慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)是慢性鼻窦炎的一个亚型，是一种鼻腔及鼻窦黏膜的慢性炎症性疾病，在鼻科学中高发，在普通人中发病率约在1%～4.3%[1]。以持续性鼻塞、流脓涕、头痛、嗅觉减退甚至丧失为主要症状，严重影响患者的日常生活及正常工作[2-3]。近年来许多研究表明，根据嗜酸性粒细胞在鼻息肉中的浸润程度，CRSwNP可分为嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉(eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps,eosCRSwNP)与非嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉(non-eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps,non-eosCRSwNP)[4]，且具有较为明显的地域、种族及环境差异，西方国家CRSwNP患者主要以大量嗜酸性粒细胞浸润为表现，伴随嗜碱性粒细胞及肥大细胞的增多，通常伴有哮喘等变应性疾病，且以Th2炎症模式为主[5]。而亚洲人群中则以非嗜酸性粒细胞(如中性粒细胞)浸润为主要特征，且以Th1或Th17炎症模式为主[6]。就治疗而言，伴鼻息肉的慢性鼻窦炎首选手术治疗[7]，解除机械阻塞、重建结构和通畅引流。有研究表明，超过50%的CRSwNP患者术后有复发情况[8]，但目前引起CRSwNP复发的因素较多且具体机制不明，鼻腔及鼻窦黏膜上皮细胞的屏障破坏，机体免疫系统失调以及定植菌和致病菌等在CRSwNP的复发中发挥作用[9]。已有研究证明核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptors, NLRP3)炎症小体在多种疾病发生发展过程中都起到了关键作用，包括CRSwNP。NLRP3作为机体固有免疫的一部分，主要识别体内的危险相关分子模式或病原相关分子模式，且主要于单核细胞、巨噬细胞、T细胞及上皮细胞等细胞胞浆内表达[10]。NLRP3炎性小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1组成[11]。

白介素-1β(IL-1β)又被称为称促炎反应细胞因子，IL-1β可以促进嗜酸性粒细胞的脱颗粒，进而增强细胞毒作用。IL-1β还参与多种黏附因子及细胞因子的合成和表达，包括 IL-18、血管细胞黏附分子、细胞间黏附分子[12]等。并在局部组织纤维化的过程发挥重要作用。

有研究表明NLRP3-(IL-1β)通路的过度激活可促进生成大量炎性因子，引起疾病的发生[12]。研究表明NLRP3炎性小体在自身免疫病、代谢性疾病、肿瘤性疾病以及多种慢性炎症性疾病的发生和发展中发挥重要作用[13]。本文将对eosCRSwNP中的NLRP3炎性小体及IL-1β的表达水平进行具体分析，并分析non-eosCRSwNP的复发与NLRP3及术前评分的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2019年12月—2021年6月在西藏自治区人民医院耳鼻咽喉科拟行鼻内镜手术的62例患者作为研究对象，其中CRSwNP患者44例(根据组织HE染色将其分为22例non-eosCRSwNP患者，22例eosCRSsNP患者)和鼻中隔偏曲患者18例(对照组)。所有患者术前3个月及1个月均停用口服糖皮质激素和鼻用内类固醇。CRSwNP的标本均来自术中切除息肉。对照组为患有鼻中隔偏曲且无鼻腔炎症性疾病患者的下鼻甲黏膜，因纳入与排除标准严格、患者均有鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大，进行了下鼻甲的部分切除，遂选用下鼻甲黏膜。所有选取的标本分别冻存于液氮并转存-80 ℃冰箱。研究均获取了患者书面知情同意。两种不用亚型CRSwNP与对照组比较症状评分有显著差异(P<0.05)，但亚型间比较无显著出差异。具体数据见表1。

纳入标准：①符合CRSwNP临床诊断标准[14];②经CT确诊；③接受鼻内镜手术治疗；④患者签署该项研究的知情同意书；⑤临床资料齐全。

排除标准：①鼻窦炎合并囊肿、血管瘤、乳头状瘤等疾病者；②合并变应性鼻炎、哮喘等其他炎症性疾病及自身免疫疾病者；③囊性纤维化、真菌性鼻窦炎、原发性纤毛运动障碍和胃食管反流疾病患者；④严重心、肾等脏器功能障碍或衰竭；⑤合并恶性肿瘤、鼻咽部肿瘤者；⑥合并高血压、糖尿病等慢性疾病者；⑦临床资料有缺失。

表1 患者临床资料及术前评分 (分，

1.2 研究方法

1.2.1 组织学分析 CRSwNP和对照组标本石蜡包埋切片4 mm进行HE染色。在65 ℃烘干玻片2～3 h后，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为3杯相同的二甲苯溶液)各浸泡5 min，100%(Ⅰ、Ⅱ)，90%，80%，70%乙醇各1 min，然后自来水冲洗3次，每次5 min。苏木素染12 s后流水冲洗10 min；伊红染8 s后水洗5 min。70%和95%乙醇各30 s，100%乙醇1 min。二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3 min，然后树胶封片，吹干1晚。随后检测嗜酸性粒细胞浸润情况。检查了5个随机选择的高倍视野并计数嗜酸性粒细胞。

1.2.2 免疫组化 在65 ℃烘干玻片2～3 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，100%(Ⅰ、Ⅱ)，90%，80%，70%乙醇各1 min。抗原修复：加热抗原修复液，在95 ℃左右放入玻片10 min，降至室温后，回收抗原修复液，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗玻片3次，然后加0.1% Tritonx-100室温孵育10 min。在PBS洗玻片3次后擦干后加10%胎牛血清室温孵育30 min。甩掉血清，加一抗后4°过夜。PBS 洗玻片3次后加二抗, 室温避光孵育1 h。PBS洗玻片3次后擦干玻片, 滴1滴DAPI 染细胞核，盖上玻片。通过显微镜检测NLRP3在eosCRSwNP和non-eosCRSwNP中的分布。随机抽取5例高倍视野，计数阳性细胞。

1.2.3 实时荧光定量PCR分析 将提取的 RNA 逆转录为 cDNA 后，用对应的引物进行定量 RT-PCR。将cDNA，2xReal PCR EasyTMMix-SYBR，正向引物，反向引物和 ddH2O 配置到总计 20 mL 的溶液中。使用合适的引物和 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒在光学循环系统上进行定量PCR。具体引物序列见表2。

表2 引物列表

1.3 Non-eosCRSwNP复发判断标准[15]

患者症状改善不明显，或者症状如闭塞、流涕、嗅觉减退、头痛等未改善，同时在内镜检查发现窦腔黏膜充血水肿、结缔组织增生或者息肉组织生成、存在广泛粘连现象、窦口发生狭窄或者关闭、存在黏脓性分泌物，则定义为复发。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 NLRP3和IL-1β在mRNA表达non-eosCRSwNP中升高

HE染色后利用显微镜计数将CRSwNP分为eosCRSwNP和non-eosCRSwNP。NLRP3炎性小体的mRNA水平：对照组(0.68±0.51)分；eosCRSwNP组(3.76±3.17)分；non-eosCRSwNP组(7.98±7.57)分。 IL-1β的mRNA水平：对照组(0.96±0.53)分；eosCRSwNP组(4.84±4.35)分；non-eosCRSwNP组(7.53±6.73)分。Non-eosCRSwNP组NLRP3和IL-1β的mRNA水平明显高于eosCRSwNP组及对照组。见图1。

图1 EosCRSwNP和non-eosCRSwNP中NLRP3炎性小体和IL-1β的mRNA水平 注：*<0.05；**<0.01；***<0.001。

2.2 NLRP3的mRNA水平与术前症状评分正相关

术前VAS评分、Land-Mackay评分及Lund-Kennedy评分与NLRP3的mRNA水平呈正相关(P<0.05)。见图2。

2.3 免疫组化eosCRSwNP和non-eosCRSwNP中NLRP3蛋白表达水平

免疫组化结果显示，non-eosCRSwNP和eosCRSwNP中NLRP3染色的表达显著增加。免疫组化NLRP3染色数量：对照组(0.39±0.59)分；eosCRSwNP组(8.45±5.78)分；non-eosCRSwNP组(18.05±7.47)分。得知NLRP3染色数量在non-eosCRSwNP和eosCRSwNP表达增高，在non-eosCRSwNP中最为显著(P<0.05)。见图3。

2.4 NLRP3与non-eosCRSwNP患者预后的关系

通过分析相关性，我们观察到non-eosCRSwNP患者术前VAS评分、Land-Mackay评分及Lund-Kennedy评分与免疫组化的NLRP3数量呈正相关。见图4。

图2 Spearman法分析NLRP3的mRNA水平与术前VAS评分、Land-Mackay评分及Lund-Kennedy评分的相关性

图3 在每个高倍镜视野下，免疫组化结果(×400)显示，non-eosCRSwNP组中NLRP3水平高于eosCRSwNP组及对照组 注：*< 0.05；***< 0.01；****<0.001。

图4 Spearman法免疫组化NLRP3与术前VAS评分、Land-Mackay评分及Lund-Kennedy评分的相关性

2.5 Non-eosCRSwNP复发相关性

NLRP3表达程度、术前VAS评分、Land-Mackay评分、Lund-Kennedy评分均在复发组鼻息肉中显著增高，并相互具有正相关关系(P<0.05)。

表3可提示，就预测复发而言，免疫组化NLRP3表达程度、术前Lund-Kennedy评分均有意义。

3 讨论

众所周知，CRSwNP可分为non-eosCRSwNP和eosCRSwNP。研究显示，超过一半的中国CRSwNP患者在组织学上表现出非嗜酸性炎症。中国嗜酸性和非嗜酸性CRSwNP患者的中性粒细胞数量均有所增加，且non-eosCRSwNP中国患者的中性粒细胞数量高于eosCRSwNP患者，表明中国CRSwNP患者的中性粒和嗜酸性粒细胞炎症存在差异[6]。

在严重的2型CRSwNP患者中，已发现中性粒细胞浸润升高。在严重的2型免疫反应中，嗜中性粒细胞浸润增加，其调控作用超过了IL-17。虽然成熟中性粒细胞在CRSwNP患者的血液中占主导地位，但在CRSwNP组织中观察到活化中性粒细胞的显著变化，表明中性粒细胞一旦进入CRSwNP微环境就被激活[16]。有研究表明在难以治疗的CRS患者中，重度或中度中性粒细胞炎症标志物升高，鼻息肉上皮下区域中性粒细胞存在增加与CRS的顽固性相关[17]。

张沈华等[18]研究表明，Nod1蛋白在鼻息肉组织中的表达增强。也有研究表明在non-eosCRSwNP中，缺氧诱导因子可诱导M1巨噬细胞表达NLRP3 炎性小体[19]。机体受到外界刺激后激活免疫系统，从而引起NLRP3炎性小体的活化[20]，其可切割白介素的前体pro-IL-1β和pro-IL-18等因子，将其转变为活化形式并释放，从而导致炎症的发生[21]。而IL-1β可以调节巨噬细胞和Th2等细胞的免疫功能，使其聚集于局部组织当中[22]，并可促进Th17的细胞分化和产生相关因子[23]，从而在CRSwNP的发生发展过程中发挥重要作用。

大量数据表明，NLRP3的激活与caspase-1结合后被激活，然后IL-1β和IL-18成熟，在细胞生长、增殖和存活中发挥关键作用。在本研究中，RT-PCR检测和免疫组化结果显示eosCRSwNP组和non-eosCRSwNP组中NLRP3及IL-1β的表达水平和NLRP3的染色表达明显高于对照组，这与已发表的报道一致[24]，且non-eosCRSwNP组要高于eosCRSwNP组。此外相对于对照组而言NLRP3染色数量在non-eosCRSwNP和eosCRSwNP中表达增高。相关性分析表明，NLRP3的RNA水平及其免疫组化蛋白表达程度与术前的VAS、Land-Mackay、Lund-Kennedy等评分呈线性相关。我们还发现了non-eosCRSwNP的复发与Lund-Kennedy评分及免疫组化的NLRP3表达程度的相关性，且均有统计学意义。结果提示NLRP3在促进CRSwNP中上皮细胞生长和炎症细胞浸润方面发挥了关键作用，且NLRP3在non-eosCRSwNP中的作用更为明显。这些结果表明，在对抗空气中微生物的过程中，NLRP3炎症小体作为模式识别受体被激活广泛的病原体相关分子模式，可能触发caspase-1的激活，导致成熟的IL-1β和IL-18，发挥促炎作用增强鼻息肉发生。

本研究的一些局限性需要阐述。首先，本研究纳入的样本量相对较小，需要大样本量和具有代表性的研究来进一步阐明这一发现。其次，我们只研究了NLRP3在CRSwNP中的表达，还需要对NLRP3在无鼻息肉的慢性鼻窦炎和慢性鼻窦炎各种表型中的表达及作用进行全面详细的研究，以进一步阐明 NLRP3在慢性鼻窦炎发病机制中的作用。

综上，NLRP3及IL-1β在non-eosCRSwNP中相比在CRSwNP及正常鼻黏膜中有较高表达并与临床症状体征存在相关性，因此，NLRP3可作为预测non-eosCRSwNP病情严重程度及复发的重要指标之一。为深入研究NLRP3及IL-1β在non-eosCRSwNP中的作用机制提供先前理论依据，也为预测non-eosCRSwNP的复发提供新的视野。最终为non-eosCRSwNP的干预研究提供新靶点。

表3 Non-eosCRSwNP患者的基本信息与复发的关系 (分，