一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定与进化分析

李亮

（广东省广州市黄埔区动物卫生监督所，广东广州 510530）

猪流行性感冒（Swine influenza）简称猪流感，是一种猪急性高度接触性传染病，病原为正黏病毒科甲型流感病毒属的猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）[1,2]。猪流感病毒主要通过呼吸道进行传播，病猪主要表现为咳嗽、打喷嚏、流鼻涕等症状，发病较急，发病率最高可达100%，传播速度较快并且与人流感密切相关，因此，猪流感对养猪业和公共卫生安全可造成严重威胁。

当前，猪群中主要流行的SIV分为H1N1、H3N2和H1N2，3种亚型，其中H1N1亚型SIV主要包括古典和禽源H1N1亚型SIV[2]。流感病毒具有极强的宿主识别特异性，通常流感病毒不会跨越种间屏障感染其他类型的宿主，但猪的呼吸道上皮细胞具有特殊的包容性，其同时拥有唾液酸α2,6和α2,3两种受体，基于此，猪被认为是禽、人流感跨种间传播的中间宿主，同时可作为不同流感病毒重组的混合器[3]。本研究通过分离到的人源猪流感病毒的遗传演化、抗原性分析，为阐明猪在流感病毒跨种传播提供了重要的病原学佐证。

1 材料和方法

1.1 样品采集、动物病毒分离及试验动物

2020年从广州某猪场采集疑似流感症状猪的鼻拭子30份，通过常规方法接种9日龄SPF鸡胚增殖病毒。试验所用鸡胚购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 病毒亚型的鉴定

利用RNA纯化试剂盒（购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司）提取病毒RNA，并以Unin-12为引物，按照反转录酶AMV试剂盒（购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司）说明书反转录合成cDNA。用特异性的亚型鉴定引物（上海生工生物工程技术服务有限公司合成）通过PCR扩增鉴定病毒亚型。

1.3 全基因序列测定与分析

1.3.1 全序列测定

吸取收获的病毒尿囊液200 μL，提取基因组并反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用SIV H1N1亚型各节段特异性引物进行PCR（上海生工生物工程技术服务有限公司合成）扩增病毒各个基因区段，胶回收PCR产物，连接转化后送上海生工生物工程技术有限公司测序。

1.3.2 病毒分子特征与遗传演化分析

利用Lasergene软件中的Seqman程序包组装各基因片段序列，通过NCBI的blast窗口进行同源性检索，用MEGA7.0绘制进化分析树，通过对HA和NA基因片段对应的氨基酸序列分析，获得该流感病毒的分子特征。

2 结果

2.1 病毒分离鉴定

通过特异的PCR鉴定分离到的病原，确认该病原为H1N1亚型流感病毒，对该病毒全基因组测序并进行生物学特性分析后，命名其为A/swine/Neimeng/03/2020（H1N1） （简称 SW/Neim/03/20）。

2.2 核苷酸同源性

通过NCBI的Blast窗口对SW/Neim/03/20病毒的8个基因片段进行同源性比对发现，除M基因、NS基因与人源SI病毒A/Swine/Fujian/0325/2008（H1N1）同源性最高，其余6个基因均与人流感病毒A/Dunedin/2/2000（H1N1）同源性最高，各基因同源性比对数据见下表（表1）。

表1 A/swine/Neimeng/03/2020（H1N1）相关基因核苷酸同源性分析

2.3 病毒序列分子特征分析

全基因测序显示，SIV SW/Neim/03/20（H1N1）的HA基因组开放阅读框有1 698个核苷酸，编码565个氨基酸，NA基因开放阅读框有1 413个核苷酸组成，编码470个氨基酸。通过HA蛋白分子的特殊构象推测，前17个氨基酸为信号肽，整个HA蛋白分为326个氨基酸的HA1和222个氨基酸的HA2两个亚单位组成，HA1和HA2由一个碱性氨基酸R连接，HA蛋白的裂解位点氨基酸基序为PSIQSR↓G，该基序不含多个碱性氨基酸，表明该分离的病毒与低致病性毒株氨基酸序列特征一致。

通过分析SW/Neim/03/20抗原表位特性发现，该毒株与经典型和类禽型H1N1 SIV比较，在HA1上的4个抗原表位（Sa、Cb、Sb、Ca）易变，每个表位均有多个氨基酸的变异（见表2），HA2部分的表位较为保守。HA氨基酸链上分布有10个潜在的糖基化位点，其中HA1 区分布在 27、28、40、71、104、142、176 和303等氨基酸位点，HA2区分布在氨基酸的497和556位点。SW/Neim/03/20毒株4个抗原表位（Sa、Cb、Sb、Ca）和潜在的 10个糖基化位点均和参考株A/Dunedin/2/2000（H1N1）所具有的状态一致。SW/Neim/03/20毒株与SIV参考株中均具有NA蛋白完整的7个糖基化位点。其中，链接区有4个(N44、N58、N63和N68)，结构域有3个(N88、N146和N235)。

表2 分离株A/swine/Neimeng/03/2020（H1N1）和参考毒株HA1蛋白氨基酸序列比较

2.4 病毒HA和NA基因核苷酸系统进化分析

通过对分离毒株HA和NA基因进行系统进化树构建与分析发现，分析的H1N1亚型猪流感病毒基因序列分为3个亚群，包括经典的H1N1，类禽的H1N1和季节性的H1N1人流感病毒。SW/Neim/03/20（H1N1）8个基因均与人流感亚群高度同源，该病毒没有发生重组，并与2000年左右的人流感毒株A/Dunedin/2/2000（H1N1）进化关系最近（图1、图2）。

图1 分离株和参考毒株HA基因进化树

图2 分离株和参考毒株NA基因进化树

3 讨论

猪的呼吸道上皮细胞具有特殊的包容性，其同时拥有唾液酸α2,6和α2,3两种受体，基于此，猪被认为是禽、人流感跨种间传播的中间宿主，同时，猪可作为不同流感病毒重组的混合器[4]。1998年，一株禽和人流感病毒的重组病毒曾在美国猪群中流行并引发大范围流感；2009年3月的甲型H1N1流感病毒由墨西哥迅速传到全球各地，对经济和公共卫生造成严重损失，该病原同为重组SIV，其基因由禽源、人源及猪源流感病毒基因三重重配组成[5]。在我国近年相继报道了多起人和猪流感重配病毒感染事件，这种重配的病毒与多基因型SIV在猪群中共流行，共流行提供了更多的病毒重组可能性[6]。人群和猪群通常缺少针对重配病毒相应的抗体，重组病毒往往会对其造成巨大损害。

在自然条件下，猪同时拥有唾液酸α2,6和α2,3两种受体，因此，猪可以感染人流感病毒。人源流感病毒抗体在猪群内处于缺失状态，这将导致人流感病毒更容易在猪群中流行，人源H3N2病毒多次感染猪群的情况，也证明了该观点[5,7]。相对于H3N2病毒，人源H1N1在猪群中分离率较低，且缺乏持续进化证据可能是H1蛋白相对保守导致的[8]。经研究发现，SW/Neim/03/20（H1N1）的HA基因与A/Dunedin/2/2000具有99.51%的同源性，而 A/Dunedin/2/2000是2000到2007年期间北半球人流感中的代表病毒毒株。分离株与A/Swine/Fujian/0325/2008（H1N1） 以及参考株 A/Dunedin/2/2000的抗原位点完全一致，该相关性说明分离株SW/Neim/03/20（H1N1）通过人—猪传播直接来自于人流感病毒，而非猪群进化而来。当前我国猪群遭遇各种重大疾病，与这些高致死、致残性疾病相比，猪流感对养猪业的危害容易被轻视甚至忽略。在疫病诊治过程中，猪流感常做为原发病诱发其他疫病对养殖业造成损害，而人源病毒在散发性的感染猪群，对猪致病性具有大流行的潜在危害，其与猪群中的其他病毒存在继续发生重组的可能，再回传到人群中，对公共卫生事业具有一定的潜在危害，需要持续监测与关注，防患未然。