河南新乡某规模化猪场猪口蹄疫抗体水平检测分析

饶丹

（信阳农林学院牧医工程学院，河南信阳 464000）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种接触性传染病，发病急、传播迅速、范围广泛，主要感染猪、牛等偶蹄类动物，通过接触传播或空气传播，主要特点以口舌黏膜、皮肤、蹄部形成糜烂、溃疡病灶为主[1]。该病是危害养猪业及其他畜牧行业的重要传染病之一，通常不表现临床症状的仔猪会突然死亡，病死率很高（严重时可达100%，尤其是14日龄以下的幼仔），也是现今危害养殖业健康发展的主要疾病，给畜牧业造成了很大的损失。

口蹄疫病毒是单股正链RNA病毒，为正二十面体球形，包含一个开放阅读框（ORF）翻译成四种结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和八种非结构蛋白（Lpro、2A、2B、2C、3A、3B、3Cpro和3Dpol）。其中，结构蛋白在宿主免疫调节中有着重要的作用，VP1高度可变，VP2和VP3相对保守，VP4高度保守。VP1和VP3的作用是抑制宿主产生干扰素以削弱宿主抗病毒的能力，VP2参与诱导自噬[2]。

本研究以新乡某规模化养猪场不同阶段猪只为研究对象，随机采集妊娠前期、妊娠中期、妊娠后期、20日龄仔猪、50日龄保育猪、90日龄育肥猪和150日龄育肥猪血液样本各30份，分离血清，用ELISA方法对不同阶段猪的血清进行检测，并对结果进行统计分析，了解该规模化猪场不同猪只口蹄疫抗体水平，对免疫程序进行调整和优化，为该规模化猪场猪口蹄疫的防控提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

根据新乡某规模化养猪场的养殖规模和养殖方式，随机采集妊娠前期、妊娠中期、妊娠后期、20日龄仔猪、50日龄保育猪、90日龄育肥猪和150日龄育肥猪血液样本各30份，检测口蹄疫的抗体水平。

1.1.2 试剂

猪口蹄疫O型抗体ELISA诊断试剂盒，猪口蹄疫A型抗体ELISA诊断试剂盒，均购自IDEXX公司。

1.2 试验方法

1.2.1 免疫背景

新乡某规模化猪场（1 000头母猪）猪口蹄疫的免疫程序如下：母猪分别在2月、6月和10月份各免疫1次，颈部肌肉注射2 mL。63日保育猪龄首免，91日龄育肥猪二免。

1.2.2 血液采集

猪站立保定方式采集血液。一般采集3～4 mL。取血后，将采血管在室温下静置2 min，待血凝后，将血样及时带回实验室提取血清备用（运输过程中避免血液过度晃动）。

1.2.3 分离猪血清

在试验过程中，要提前准备相应的移液枪和经过高温灭菌的枪头。将接种过猪口蹄疫疫苗的猪血在常温下混合均匀，并预先标记出所需离心管和猪血样的序号。使用移液枪将猪血注入离心管中，再放入微型离心机中，3 500～4 000 rpm离心5～10 min。取分离后的上清液，置于冰箱内低温保存备用。在操作过程中应避免反复冻融。

1.2.4 血清抗体检测方法

按照试剂盒严格操作。具体步骤；①用去离子水将10倍浓缩的PBS-吐温进行稀释；用ELISA稀释缓存液将10倍浓缩的酶标抗体进行稀释。②将2个孔中分别加入2个不同稀释度的阳性对照血清(1/10、1/30)，然后进行稀释，在4个相对应的孔中分别加入50 μL阴性对照，在2个相对应孔中分别加入50 μL 1/10倍和1/30倍稀释的阳性对照。反应1 h。③每个孔内均加入25 μL稀释后的HRPA/O-结合物；反应1 h。④每孔分别加入200 μL的洗涤液，在常温静置3 min，甩去孔内液体，重复3次，最后一次静置5 min；然后将块板中残留的洗涤液扣拍到吸水材料上。⑤在所有的孔中分别加入50 μL的底物/显色液；常温下避光静置20 min，从加入第1孔时开始计时。⑥按照每孔加入底物溶液的顺序，分别加入50 μL终止液。⑦用荧光酶标仪在450 nm的波长下读取每个孔的OD值，并计算阻断率。

1.2.5 合格标准

阻断率≥50%时为阳性；阻断率＜50%时为阴性。

2 结果与分析

2.1 猪A型口蹄疫抗体水平结果与分析

2.1.1 妊娠期母猪A型口蹄疫抗体水平检测结果与分析

通过表1所示，母猪妊娠前期A型口蹄疫抗体的阳性率为93.3%，妊娠中期阳性率为96.6%，妊娠后期的阳性率为100%；妊娠前期离散度为15.46%，妊娠中期离散度为10.6%，妊娠后期离散度为13.34%。说明这批母猪A型口蹄疫抗体水平较高，个体之间抗体水平差异不大且相对稳定。

表1 妊娠母猪A型口蹄疫抗体水平检测结果

2.1.2 仔猪和保育猪A型口蹄疫抗体水平检测结果与分析

由表2可知，20日龄仔猪A型口蹄疫抗体阳性率为86.6%，离散度为15.25%，表明整体A型口蹄疫抗体水平合格，个体间差异不大，能抵御A型口蹄疫野毒感染；50日龄保育猪A型口蹄疫抗体阳性率为50%，离散度为14.48%，表明50日龄保育猪群整体母源抗体水平在逐渐下降，目前母源抗体水平仍较高，不用进行首免。

表2 仔猪和保育猪A型口蹄疫抗体水平检测结果

2.1.3 育肥猪A型口蹄疫抗体水平检测结果与分析

由表3可知，90日龄育肥猪A型口蹄疫抗体阳性率为86.6%，离散度为11.1%，150日龄育肥猪阳性率为90%，离散度为14.96%。说明这批育肥猪猪A型口蹄疫抗体水平较高，个体之间抗体水平差异不大且相对稳定。

表3 育肥猪A型口蹄疫抗体水平检测结果

2.2 猪O型口蹄疫抗体抗体水平结果与分析

2.2.1 妊娠母猪O型口蹄疫抗体水平检测结果与分析

由表4可知，母猪妊娠前期、妊娠中期、妊娠后期O型口蹄疫抗体阳性率均为100%，妊娠前期离散度为4.8%，妊娠中期离散度为7.8%。妊娠中期离散度为6.98%。表明3个阶段整体抗体水平较高，个体间差异不大。

表4 妊娠母猪O型口蹄疫抗体水平检测结果

2.2.2 仔猪和保育猪O型口蹄疫抗体水平检测结果与分析

由表5所示，20日龄仔猪O型口蹄疫抗体阳性率为100%，离散度为12.32%；表明抗体水平较高，能抵御野毒感染；50日龄保育猪阳性率为76.66%，离散度为24.41%，表明O型口蹄疫抗体水平逐渐下降，但抗体水平较高，说明50日龄保育猪不用进行O型口蹄疫疫苗首免。

表5 仔猪和保育猪O型口蹄疫抗体水平检测结果

2.2.3 育肥猪O型口蹄疫抗体水平检测结果与分析

通过表6可看出，90日龄育肥猪O型口蹄疫抗体阳性率为100%，离散度为10.47%，150日龄育肥猪阳性率为100%，离散度为17.18%。说明这批育肥猪O型口蹄疫抗体水平较高，个体之间抗体水平差异不大且相对稳定。

表6 育肥猪O型口蹄疫抗体水平检测结果

3 讨论

口蹄疫是一种传染性极强的病毒性疾病，对我国养猪业造成的经济损失重大，目前防控口蹄疫仍以接种灭活疫苗为主。农业农村部制定的《国家动物疫病强制免疫指导意见（2022—2025年）》规定口蹄疫免疫抗体合格率需常年保持在70%以上[3]，表明通过检测口蹄疫抗体水平评价养殖场动物免疫情况尤为重要。

本研究针对新乡某规模化猪场进行了猪口蹄疫抗体水平监测，为了从总体上了解该养殖场猪口蹄疫抗体水平，本试验采用常规的ELISA方法对该规模化猪场不同阶段猪群采血，分离血清，检测血清中抗体水平，并对数据进行分析，结果得知；A型、O型口蹄疫抗体检测中妊娠期阳性率都在90%以上，离散度低于30%，说明妊娠阶段母猪口蹄疫抗体水平达到国家要求标准（70%以上），表明免疫情况良好。王慧等[4]研究表明，猪胎盘是上皮绒毛膜类型，猪在胎儿时期不能从母体获得母源抗体，新生仔猪通过吮吸初乳经消化道吸收获得母源抗体。母源抗体可以保护初生仔猪免受病原侵袭，在提高仔猪抗病力和成活率方面发挥着重要作用。在O型口蹄疫和A型口蹄疫抗体检测中20日龄仔猪吮吸母乳获得母源抗体，且抗体水平较高，A型86.6%，O型100%，说明仔猪能抵御野毒感染。吕立新等[5]研究表明，仔猪30日龄后母源抗体平均效价逐步下降，到60日龄已进入敏感区，此时需要根据猪只抗体水平及时接种疫苗。本研究显示，A型口蹄疫母源抗体阳性率由20日龄的86.6%下降至50日龄的50%，O型口蹄疫母源抗体阳性率由20日龄的100%下降至50日龄的76.6%，抗体阳性率虽持续下降，但仍处于安全保护期内。故该猪场在保育猪63日龄进行首免合理。A型口蹄疫检测中90日龄育肥猪阳性率为86.6%，150日龄育肥猪阳性率为90%；O型口蹄疫检测90日龄和150日龄育肥猪阳性率均为100%，说明二免前和二免后猪只抗体水平较好，猪只能够抵御野毒感染的风险。故该猪场91日龄进行二免合理。本研究显示O型口蹄疫疫苗免疫抗体水平高于A型，该结果和陈一峰[6]的研究结果一致。说明以后防控中需留意A型口蹄疫的抗体水平，及时监测，发现问题及时调整。

接种灭活疫苗虽然是最有效的控制策略，但是FMDV对酸和热的敏感性较高，导致在猪的运输过程中存在一定感染风险。随着我国社会发展，科学家们通过高温传代、扩增、纯化获得了一种热稳定的FMDV突变体（VP1第13位丙氨酸突变为苏氨酸）可以稳定口蹄疫病毒衣壳，FMDV突变体在中和抗体滴度方面表现出更高的免疫原性[7]，确保了疫苗接种保护率的同时在运输过程中提升了疫苗的稳定性，降低了运输成本。

疫苗的接种效果受佐剂和接种部位的影响，现在市面上口蹄疫疫苗的佐剂都是油佐剂，对猪免疫后有较大的副反应，造成局部炎症、肉芽肿的形成。研究表明，AEAR（免疫调节多糖）作为FMDV灭活疫苗的佐剂，在小鼠的动物实验中取得了突破进展，AEAR显著诱导FMDV特异性抗体滴度和淋巴细胞活化。中剂量AEAR通过CD4+T细胞分泌IL-4和IFN-γ刺激Th1/Th2型应答。AEAR显著升高有效T淋巴细胞计数。重要的是，AEAR显著激发了高效的CTL反应。诱导FMDV特异性抗体滴度和淋巴细胞活化[8]，作为新一代口蹄疫灭活疫苗的中药佐剂，在未来的发展中有着重要的作用。此外，疫苗的皮内（ID）接种被认为是一种有效且高效的牲畜疫苗接种方式，ID疫苗接种有可能节省FMD疫苗的生产成本，与肌内（IM）途径相比，较低的抗原含量可有效地在猪和牛中产生保护性免疫，与使用注射针相比，使用无针递送系统进行ID疫苗接种可以更有效、更安全、更快速地对更多动物进行疫苗接种，在无针ID疫苗接种可以排除肌肉中肉芽肿的形成。减少生产成本提高猪肉利用率[9]。

尽管DNA疫苗的免疫原性不理想，与传统疫苗相比，存在免疫原性不足的问题，但它们仍被认为是常规疫苗的潜在替代候选疫苗。因为它有不存在灭活的问题，有更高的安全性，更长的保质期。同时，DNA疫苗可以携带针对不同血清型或新出现毒株的多种保护性抗原表位，导致交叉保护性免疫增强。各种DNA递送系统，包括纳米颗粒，已被广泛探索和验证，以进一步增强DNA疫苗的免疫原性。DNA疫苗被认为是替代疫苗候选者，研究表明，PLGA纳米粒子会促进与细胞膜的静电相互作用随后往细胞内运输，诱导T淋巴细胞增殖，并增强抗原表达。与普通的FMD灭活疫苗相比引发更强的细胞免疫反应[10]。