益肾清络活血方对CFA大鼠OPG/RANKL通路的影响及机制

李丹凤，王 雯，许 萍，陈修平，李 艳

(1.皖南医学院研究生学院，2.皖南医学院弋矶山医院中医科，国医大师李济仁工作室，安徽 芜湖 241002)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因不明以滑膜炎症增生、软骨破坏等为特征的自身免疫性疾病，致机体出现不可逆的关节损伤，甚至残疾，严重影响身心及社会健康[1-2]。目前，现代医学对于RA患者的治疗重点多是免疫抑制加非甾体类消炎药和抗风湿药，长期服用有一定的副作用[3]。因此，迫切需要开发一种治疗RA的药物用于临床。新安医家李艳主任在李济仁教授清络饮(Qing-luo-yin,QLY)基础上，自拟益肾清络活血方(Yisheng-Qingluo-Huoxie prescription,YSF)，临床疗效明显，但相关机制尚未明确。

据很多文献报道RA的机制，多由于炎症、免疫的失调以及骨侵蚀破坏[4-7]，同时，滑膜炎是关节骨侵蚀的主要原因，与一些维持破骨细胞稳态的调节因子缺乏控制密切相关，如核因子受体激活因子B配体(nuclear factor receptor activator B ligand,RANKL)水平升高和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)下降。因此，目前RA治疗的主要目的是降低免疫炎症反应，抑制关节恶病变和骨损伤的发展，进而保护关节功能。故本研究旨在以AIA模型为基础，初步研究新安YSF方是否在抑制炎症反应及骨保护方面发挥作用。

1 材料与方法

1.1 动物雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量(200±20) g，6周龄，共32只，购自南京青龙山实验动物公司，生产许可证：SCXK(上海)，2018-0004。本研究经过皖南医学院实验动物伦理委员会批准，在SPF动物房适应性喂养7 d后，用于实验研究。

1.2 药品与试剂QLY成份：苦参、黄柏、黄柏各9 g、萆薢10 g；YSF成份：QLY加炙黄芪30 g、当归15 g、炒菟丝子12 g、仙灵脾12 g、鸡血藤15 g、红藤15 g、法半夏9 g、蒲公英20 g，按照古方与现代剂量的换算倍数计算，大鼠每日灌胃YSF与QLY剂量换算成生药量分别为14.863、9.87 g·kg-1，中药材购于皖南医学院弋矶山医院中药房；完全弗氏佐剂(CFA)与芽孢杆菌Calmette-Guérin (BCG)购于Rebio Scientific(中国上海)和Rebio Scientific(美国雷德蒙德)。ELISA ：TNF-α、IL-1β(杭州联科生物，批号为：A382H01112、A301BH00752)、OPG、RANKL(Biotech，批号：EIA-3509、EIA-3390)；OPG、RANKL、β-actin抗体(ABclonal，货号分别为：A10551、A2550、AC038)；二抗Anti-Rabbit IgG(Thermo，货号为：C31460100)；BCA增强型试剂盒(Beyotime，货号P10010)；化学发光检测试剂盒(USA，货号P90719)；SDS-PAGE蛋白染色机上样缓冲液(Beyotime，货号P0281S)；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(通用型，50X)(Beyotime，货号：P1045)、RIPA裂解液(Beyotime，货号：P0013B)；TBS缓冲液(biosharp，货号BL602A)；ReverAid第一链cDNA合成试剂盒(Thermoscientific，货号01049288)和Universal qPCR Master Mix(BioLabs，货号10086870)。

1.3 仪器RE52CS型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；LC-SFJ-10手持式匀浆机(上海力辰西仪器科技有限公司)；Anthos Zenyth 200 型全波长酶标仪(英国 Biochrom 公司)；PCR仪(美国ABI 7500 Real Time PCR System，Applied Biosystems)；核酸蛋白测定仪(美国ABI Qubit 荧光定量)；SimpliAmp PCR仪；EG1150H组织包埋机、RM2245转轮式切片机、HI1210摊片机、HI1210烤片机、AutoStainerXL(ST5010)自动载玻片染色机均购于Leica，德国；BX54光学显微镜、DP27成像系统均购于Olympus，日本；PowerPac Bsic型电泳仪、Mini Subcell GT型水平电泳槽(美国Life Technologies公司)；AlphaImager HP凝胶成像系统(美国ProteinSimpie 公司)；DV215CD型精密电子天平(美国Ohaus公司)。

1.4 方法

1.4.1模型制备 在SPF动物房隔离室适应性喂养7 d后，制备模型：75%乙醇消毒大鼠左足后跖部，皮下注射CFA 0.1 mL，诱导AIA模型大鼠，随机取8只为Normal组大鼠，以生理盐水代替CFA，剩余大鼠全部予以CFA注射。其中CFA的制备，参照文献[8]。

1.4.2分组及给药 按照随机数字法，取8只作为Normal组，剩余造模成功的分为：AIA组，AIA-YSF组和AIA-QLY组，每组各8只，造模首日起，YSF组和QLY组分别给予14.863、0.987 g·kg-1·d灌胃量；剩余Normal与AIA全部予以等剂量生理盐水。

1.4.3大鼠关节炎评分及体质量的评估 关节炎评分由两位独立的研究人员量化，根据每只爪子的炎症表现，评分为1～4分[9]，同时称体质量，并观察其一般临床情况。

1.4.4HE染色法观察大鼠组织关节的病理变化 取大鼠右后肢膝关节与踝关节，置于10%中性福尔马林溶液中固定24 h以上，经过修块、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、捞片、烤片，从染色机中取出，中性树胶封片，最后于正置显微镜下观察关节组织病理变化。

1.4.5IHC检测大鼠关节中p-p65、MMP3的表达 取大鼠右后肢关节的石蜡切片，通过IHC进行定位评价，并与抗体p-p65、MMP3孵育在4 ℃，按制造商的说明，用二氨基联苯胺四盐酸盐进行显色反应，胞核苏木精反染，置显微镜下观察关节组织病理变化。

1.4.6Q-PCR分析 用TRIzol试剂裂解滑膜组织。氯仿萃取后，有机相被丢弃。将水中总mRNA用异丙醇沉淀，再用75%乙醇纯化，在SimpliAmp上作为cDNA合成的模板热循环器(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA)。获得的cDNA随后使用7500 Real-Time PCR系统进行qPCR分析。以β-acin为内参，根据2-△△CT法计算检测基因的相对表达量。引物序列详细如下：β-actin，F：5′-TGTCCAC CTTCCAGCAGATGT-3′，R：5′-AGCTCAGTAACAGTC CGCCTAGA;OPG-3′，F：5′-CCTTGCCCTGACCACTCT TAT-3′，R：′-CACACACTCGGTTGTGGGT-3′;RANKL，F：5′-GCAGATTTGCAGGACTCGACT-3′;R：5′-CCCC ACAATGTGTTGCAGTT-3′;MMP3，F：5′-GACACCAG CATGAACCTTGTT-3′;R：5′-GGAACCGAGTCAGGAC TATG-3′;TIMP-1，F：5′-CCTTCTGCAATTCCGACCT CGTC-3′;R：5′-CGGGCAGGATTCAGGCTATCTGG-3′。

1.4.7ELISA分析TNF-α、IL-1β、OPG、RANKL的表达 动物麻醉后，促凝管予以腹主动脉取血，室温静置2 h，3 500 r·min-1，离心10 min，根据试剂盒说明书，检测血清中各指标的定量表达。

1.4.8Western blot检测大鼠滑膜中OPG与RANKL蛋白表达 取大鼠双后肢的滑膜组织，将其剪成小块，加入蛋白酶抑制剂(100X)、磷酸酶抑制剂(50X)、蛋白裂解液(RIPA)一定比例的混合液，冰上裂解，于4 ℃、12 000 r·min-1、离心10 min，取上清，BCA试剂盒，定量蛋白质含量，SDS稀释缓冲液稀释后的样品沸水变性，分等份，-80 ℃下保存。配制10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶，上样、电泳、转膜、封闭、洗涤、显影，最后用ImageJ软件分析其灰度值。

2 结果

2.1 大鼠体质量、关节炎症评分的变化如Tab 1所示，自继发性炎症d 15开始，YSF组的AIA大鼠关节炎评分明显低于AIA模型大鼠，且体质量未见明显下降(P<0.05，P<0.05)，观察期结束时，关节炎症趋于缓和，体质量未见明显异常。

2.2 关节病理Normal组大鼠踝关节未出现异常病理变化。AIA组较Normal组出现明显的滑膜浸润、软骨破坏以及骨侵蚀。经YSF与QLY治疗后，大鼠关节滑膜腔相对比较完整。但Fig 1示YSF较QLY在滑膜浸润方面疗效明显。

2.3 YSF经免疫组化法在大鼠关节中p-p65及MMP3的表达Fig 2、3示，p-p65以及MMP3在大鼠关节部位的阳性表达，与Normal组比较，AIA组阳性表达最明显；QLY次之，YSF与Normal最为接近。

Tab 1 Effect of YSF on weight and arthritis scores and of RA model

Fig 1 Effect of YSF on histopathological changes of rat ankle joints (HE，400×)

Fig 2 Effect of YSF on p-p65 in rat ankle tissues (IHC，400×)

Fig 3 Effect of YSF on MMP3 in rat ankle tissues (IHC，400×)

2.4 RT-PCR检测滑膜中RANKL、OPG mRNA的表达结果Tab 2所示，与Normal组比，AIA组大鼠明显升高滑膜组织中RANKL的mRNA表达水平，(P<0.05)，降低OPG的mRNA表达(P<0.05)。其中YSF下调了滑膜中RANKL的表达(P<0.01)，上调了OPG的mRNA的表达(P<0.01)。

Tab 2 mRNA expression of RANKL and

2.5 ELISA分析TNF-α、IL-1β、RANKL、OPG、OPG/RANKL的表达如Tab 3所示，与Normal组相比，血清中TNF-α、IL-1β和RANKL水平在AIA模型中明显升高(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，OPG、OPG/RANKL则明显下降(P<0.01，P<0.01)，而YSF明显抑制其炎症指标的升高，升高OPG及OPG/RANKL水平(P<0.01，P<0.01)。

2.6 Western blot检测大鼠滑膜中OPG与RANKL蛋白的表达Fig 4示，与Normal组比，AIA组大鼠滑膜中OPG表达量明显降低(P<0.01)，RANKL的蛋白表达则升高(P<0.05)；经YSF治疗后，OPG明显高表达(P<0.05)，而RANKL则明显低表达(P<0.01)，遗憾的是，QLY的滑膜蛋白表达未见明显的统计学差异。

3 讨论

传统中医中药配方，依据“君臣佐使”理论可以通过增效、减毒来改善RA的临床症状。QLY是新安流派“张一贴”第14代传人李济仁教授疗痹病的经典名方，以苦参、黄柏、萆薢、青风藤为核心药，尤善治疗热痹。前期课题组经过了大量的实验研究，发现其具有有效性、相对安全性和成本-效果等优势[10-11]，故选择其为阳性对照药，而不是一贯以临床常用甲氨蝶呤、来氟米特等为对照，此举亦是在祖国中医药被大力弘扬的背景下，选取中药有效方剂为对照。随着疾病的进展，RA患者后期多出现肝肾亏虚、经络受阻之象，仅靠单纯的清热除痹、通络止痛之法，疗效尚未达到理想预期。为此，国医大师李济仁教授嫡系传人李艳主任在“痿痹统一论”思想指导下，基于益肾固本、气血双补的治法，通过QLY加味创制“益肾清络活血方”。该方在QLY基础上增加菟丝子与仙灵脾以温补肾阳；炙黄芪、当归以补益气血；鸡血藤、红藤行血止痛；法半夏兼顾祛痰燥湿；重用蒲公英增强基础方的清热之功。相对于清络饮，该方清泄之性因补益而缓，临床适应面更广；以肾为纲，通过益肾固精，增强全方强骨通络之效。其临床应用广泛，具有明显的治疗RA效果[12-13]。

Fig 4 Effect of YSF on expression of OPG and RANKL protein in synovial tissues of AA model rats

Tab 3 Effects of YSF on serum TNF-α，IL-1β，OPG，RANKL and OPG/RANKL in AIA model rats

文献报道[14]，CFA诱导的RA动物模型具有稳定、可靠、价廉、易获得的特点，在对称关节受累、软骨的降解破坏，滑膜炎或浸润等方面与人的RA具有相似的临床特征。因此，广泛应用于抗RA药物的临床前药理评价。加强注射CFA后，发现AIA大鼠的炎性症状逐渐加重，足爪肿胀、AI评分较高，体质量减轻。而YSF组体质量未见减轻，提示YSF不产生全身毒性。来自活化的巨噬细胞和滑膜成纤维细胞的关键促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等是引起RA炎症的主要因素[15]，实验到最后阶段，发现AIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平异常升高，提示RA中AIA模型建立成功。结果示YSF下调TNF-α、IL-1β的表达，改善炎症环境。同时YSF组组织病理学参数、MMP3及p-p65的表达较AIA组，有强大的抑制作用。此外，破骨细胞介导的骨破坏通过异常的OPG/RANKL轴发生，且OPG/RANKL的比值可以决定骨变化方向，比值越低，表明骨流失增加[16]。OPG作为一种RANKL抑制剂，是通过激活破骨细胞和骨吸收而形成破骨细胞的关键因子[17]。在本研究中，YSF减轻了AIA大鼠关节软骨和骨的损伤，恢复了血清和滑膜组织[18]中RANKL水平，增加OPG水平，提高OPG/RANKL比值，可能抑制炎症诱导的破骨形成，表明YSF对骨的保护可能与OPG/RANKL的上调有关。

综上，本研究初步发现YSF对AIA所致关节炎局部、全身的炎症反应和骨侵蚀具有一定的抑制作用。其机制可能与抑制炎症因子的释放，促进骨保护，升高OPG/RANKL途径而减少骨损伤相关。该研究“以肾为纲”，丰富了新安医学代表理论“固本培元”的基本内涵。然而仍存在一些局限性。需要建立更多的体内外RA模型，明确YSF治疗RA的具体分子机制，分析RA的关键病理基因和蛋白以及后期临床上应加强YSF的提取工艺或成分，使其在患者体内发挥更明显的抗RA作用。