岩白菜素在MDCK-MDR1细胞模型中的跨膜转运机制

吴秀稳，温 然，王 娜，李 丽，王苑宇

(1.河北医科大学药学院，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000)

岩白菜素(bergenin)属于天然异香豆素，是岩白菜、落新妇与紫金牛等植物的主要化学成分[1]。现有研究表明，岩白菜素具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种药理作用[2-5]。在中枢神经系统调节方面，岩白菜素可以通过对脑内氧化应激的调控和谷胱甘肽含量的调节发挥抗麻醉作用[6]，还可以通过抑制胆碱酯酶活性、抗氧化活性和降低p-tau蛋白水平减轻认知功能障碍，改善阿尔茨海默症[7]。血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是存在于脊椎动物的血液循环与中枢神经系统之间的一层细胞屏障，克服BBB是物质或药物作用于中枢神经系统的关键。为了进一步支持和扩大岩白菜素在中枢神经系统中的应用，本研究以转染了人多药耐药基因。(multidrug resistance gene 1，MDR1)的马丁达比犬肾上皮(Matin-Darby canine kidney，MDCK)细胞构建的单层模型研究岩白菜素的透BBB行为。MDR1，又称P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，在BBB内皮管腔侧高表达，可选择性地将基质从脑脊液转运至血液，限制血液中的物质进入脑组织[8]。MDCK-MDR1细胞单层模型能够稳定表达大量P-gp，细胞间紧密连接和酶系与脑的内皮细胞相似，药物在该模型上的透过性与体内实验结果有较大的相关性；此外，该模型培养周期短，7 d左右便可用于实验；因此，该模型是研究中枢神经系统药物跨膜转运及机制的理想模型[9-10]。本研究采用MDCK-MDR1细胞单层模型模拟岩白菜素透BBB跨膜转运，同时结合分子对接和P-gp抑制剂维拉帕米对岩白菜素跨膜转运特性的影响分析，阐释岩白菜素的透BBB转运机制，为岩白菜素的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料MDCK-MDR1细胞(上海中亚生物基因研究所，代数为25～30代)；岩白菜素、阿替洛尔、盐酸维拉帕米(上海源叶生物科技有限公司，质量分数>98%，批号分别为H14J10Z79791、B30N6R6660、Y05J6C2)；咖啡因(中国计量科学研究院，质量分数>98%，批号GBW(E)100063)；3402型12孔聚碳酯膜Transwell板(美国Corning Costar公司，批号22720039)；DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(美国Gibco公司，批号分别为C11995500BT、10099141C、25200056、C20012500BT)；青-链霉素(北京索莱宝科技有限公司，批号20200306)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(美国Sigma公司，批号M2003)；BCA蛋白定量检测试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记山羊抗兔IgG、β-actin、电转缓冲液、电泳缓冲液、ECL、显影定影试剂(武汉Servicebio公司，批号分别为G2026、G2013、G2002、G2003、GB23301、GB23303、GB12001、G2017、G2018、G2014、G2019)；0.22 μm PVDF膜(美国Millipore公司，批号ISEQ00010)；Anti-P-gp抗体[EPR10364-57](英国Abcam公司，批号ab170904)；蛋白Marker(加拿大Fermentas公司，批号26616)；色谱级甲醇(美国TEDIA公司，批号20055202)；水为双蒸水。AIR TECH超净工作台(苏净集团安泰公司)；NU-5810E型CO2气体培养箱(美国Nuaire公司)；TDZ4-WS低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；新华医疗LMQ.C型立式压力蒸汽灭菌器(济南辰卓医疗器械有限公司)；MERS00002细胞电阻仪(美国Millipore公司)；Sunrise酶标仪(奥地利Tecan公司)；THZ-98C恒温振荡培养箱(上海双旭电子有限公司)；1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 从液氮中取出冻存的MDCK-MDR1细胞，于完全DMEM培养液(含10%胎牛血清和1%青-链霉素)、37 ℃、5% CO2条件下培养。细胞汇合率约80%时传代，传代比例为1 ∶3～1 ∶5，每2～3 d传代1次。

1.2.2Western blot法验证MDCK-MDR1细胞中P-gp稳定高表达 选取常规培养的MDCK-MDR1细胞(未转染MDR1的MDCK细胞作为对照组)，接种于直径为10 cm的培养皿中，每组设3个平行，置于37 ℃、5% CO2条件下培养，细胞汇合率约90%时，收集细胞，提取总蛋白，采用Western blot法检测P-gp的表达[11]，如Fig 1，MDCK-MDR1细胞中P-gp的表达量明显高于MDCK细胞中P-gp的表达量；采用ImageJ软件进行条带灰度分析，MDCK-MDR1细胞中P-gp的表达量大约是MDCK细胞的18倍；因此，P-gp在MDCK-MDR1细胞中稳定高表达。

Fig 1 Expression levels of P-gp in MDCK cells

1.2.3MTT法测定岩白菜素的细胞毒性 制备密度为5×107个·L-1的MDCK-MDR1细胞悬液，接种于96孔板中，每孔加入200 μL；空白组只加入培养液。放入培养箱中孵育24 h后，吸净培养液，药物组依次加入用HBSS溶液配置的5、10、20、40 μmol·L-1的岩白菜素溶液，对照组和空白组加入空白HBSS溶液，每组设6个复孔，置于培养箱中孵育4 h，吸净药液或HBSS溶液；加入5 g·L-1的MTT溶液，每孔20 μL，置于培养箱中孵育4 h，每孔加入酸化三联液100 μL，过夜，在492 nm测定吸光度值(OD)值，计算细胞存活率/%=(药物组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.2.4分子对接 从PubChem化合物数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取岩白菜素、盐酸维拉帕米的分子结构，将结构导入Schrödinger软件，经过加氢、结构优化、能量最小化处理后作为分子对接的配体分子。采用Swiss-Model在线服务器(https：//swissmodel.expasy.org/)构建P-gp靶点蛋白结构，选择ABCB1蛋白靶点(PDB ID：7A69)作为同源模板；采用Maestro11.9平台，Schrödinger Maestro软件中的Protein Preparation Wizard处理蛋白结构：去除结晶水，补加缺失的氢原子，修复缺失键信息，修补缺失肽段，并对蛋白进行能量最小化以及几何结构的优化；采用Glide模块对P-gp进行预处理、优化，并利用OPLS3e力场进行约束最小化处理；化合物结构按LigPre模块的默认设置制备；在Glide模块中进行筛选时，导入制备好的受体，将原配体作为参照，在受体网格生成活性位点位置；最后通过SP方法进行分子对接及筛选[12]。分析配体和P-gp的作用模式，得到其与蛋白残基作用的情况，并记录化合物的结合能。

1.2.5岩白菜素体外跨膜转运

1.2.5.1 MDCK-MDR1细胞单层模型的建立与验证 按照操作规程[10]，制备密度为8×107个·L-1的MDCK-MDR1细胞悬液，并接种于12孔Transwell的顶(Apical，AP)端，每孔加入500 μL，底(Basolateral，BL)端加入1 500 μL完全DMEM培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中连续培养7 d，每天换液；采用跨膜电阻和阳性对照药物(透过良好的咖啡因和透过不良的阿替洛尔)渗透性评价MDCK-MDR1单层模型的完整性和紧密性。

1.2.5.2 岩白菜素在MDCK-MDR1细胞单层模型中的双向转运 按照“1.2.5.1”项下方法制备MDCK-MDR1细胞单层模型，电阻验证合格后，按照操作规程[10]，将AP端和BL端的培养液吸净，用37 ℃的HBSS溶液洗涤两端各两次，之后补加HBSS(AP端500 μL，BL端1 500 μL)，于恒温振荡培养箱(37 ℃，50 r·min-1)孵育30 min后，吸走HBSS溶液(留存，备用)，根据实验设计，分别在Transwell小室两端加入岩白菜素测试液和HBSS溶液(AP端500 μL，BL端1 500 μL)。阳性对照药物(咖啡因和阿替洛尔)的转运只AP端给药。AP端给药、BL端取样分析为吸收转运试验；BL端给药、AP端取样分析为外流试验。给药后于恒温振荡培养箱孵育。给药浓度为5、10、20、40 μmol·L-1，按设定的时间点(30、60、90、120 min)收集接收端溶液200 μL，取样后以HBSS溶液补足体积。实验设置4个平行孔。所取样品于-20 ℃冰箱中保存。测定转运实验后细胞单层的电阻值，确保单层模型的完整性。

1.2.5.3 维拉帕米对岩白菜素双向转运的影响 按照“1.2.5.1”项下方法制备MDCK-MDR1细胞单层模型，取合格的MDCK-MDR1细胞单层模型进行双向转运实验。岩白菜素与维拉帕米联合给药组：吸收转运试验时，向AP端加入含20 μmol·L-1岩白菜素和100 μmol·L-1维拉帕米的混合液，BL端加入含100 μmol·L-1维拉帕米的HBSS溶液；外流试验时，向BL端加入含20 μmol·L-1岩白菜素和100 μmol·L-1维拉帕米的混合液，AP端加入含100 μmol·L-1维拉帕米的HBSS溶液。岩白菜素单独给药组：吸收转运试验时，向AP端加入20 μmol·L-1岩白菜素溶液，BL端加入HBSS溶液；外流试验时，向BL端加入20 μmol·L-1岩白菜素溶液，AP端加入HBSS溶液。给药后于恒温振荡培养箱上温育90 min后，收集接收端的样品。其余操作同“1.2.5.2”项。

1.2.6HPLC-UV法测定岩白菜素的含量

1.2.6.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)；流动相为甲醇和0.1%乙酸水(30 ∶70)，流速设置为1 mL·min-1；检测波长设置为270 nm；柱温设置为30 ℃；样品进样量为20 μL。

1.2.6.2 样品处理 取出冷冻保存的转运样品于室温放置至融化，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.2.6.3 专属性试验 在“1.2.6.1”项色谱条件下，空白基质、对照品溶液以及样品的色谱图见Fig 2，岩白菜素的保留时间约为5.563 min。

1.2.6.4 标准曲线的制备 用“1.2.5.2”项下留存的第三次洗涤细胞的HBSS溶液配制岩白菜素对照品溶液，浓度依次为0.2、1、5、10、20、50 μmol·L-1，采用“1.2.6.1”项HPLC色谱条件分析测定，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品摩尔浓度(X/μmol·L-1)为横坐标，进行线性回归，得岩白菜素的回归方程Y=20.962X+10.289(r=0.999 6)，线性范围为0.2～50 μmol·L-1。

1.2.6.5 精密度、准确度、回收率和稳定性试验 用HBSS溶液配制5、20、40 μmol·L-1的低、中、高3个浓度的岩白菜素质控(QC)样品，每种浓度平行制备3份。0.45 μm微孔滤膜过滤后，采用“1.2.6.1”项HPLC色谱条件分析。1 d内连续测定3次，计算日内精密度；1周内测定3 d，计算日间精密度。通过回归方程计算得到检测浓度，与真实浓度比较得到准确度。回收率是通过比较加入HBSS溶液处理后样品峰面积与等量岩白菜素直接加入甲醇中的峰面积比值来计算。将上述3个浓度的QC样品放入-20 ℃冰箱中冷冻24 h，取出放置室温自然解融，然后冷冻12～24 h，反复操作3次后，按“1.2.6.2”项处理方法处理，按“1.2.6.1”项HPLC色谱条件分析，考察受试化合物的冻融稳定性。本试验条件下，岩白菜素低、中、高3个浓度的日内精密度RSD为1.65%、2.23%、1.29%，日间精密度RSD为3.64%、4.35%、4.07%；日内准确度为96.55%、98.43%、105.46%，日间准确度为94.97%、97.13%、95.33%；回收率为83.98%、89.27%、88.68%；稳定性为93.45%、97.31%、101.08%；符合生物样品分析的方法学要求。

Fig 2 HPLC chromatograms of blank HBSS solution (A)，reference solution (B)，and samples

1.2.7数据处理 表观渗透系数Papp=dQ/dt×1/A×1/C0计算[10]；式中，Papp单位为cm·s-1；Q是累积转运量，单位为μmol；dQ/dt是速率，单位为μmol·s-1；C0是受试化合物在给药端的初始浓度，单位为mmol·L-1；A是聚碳酯膜的表面积，单位为cm2。外排率ER=Papp BL→AP/Papp AP→BL计算。实验数据采用SPSS 16.0软件进行处理，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。

2 结果

2.1 MTT实验结果不同浓度的岩白菜素作用MDCK-MDR1细胞后，细胞存活率均>95%(Fig 3)，因此，岩白菜素浓度为5～40 μmol·L-1，在4 h内对MDCK-MDR1细胞无影响。

Fig 3 Effect of bergenin on viability

2.2 分子对接结果维拉帕米和岩白菜素分别与靶点蛋白P-gp分子对接，将对接后化合物与蛋白形成的复合物利用Pymol 2.1软件进行可视化，得到化合物与蛋白的结合模式，根据结合模式可以清晰的看到化合物与蛋白口袋相结合的氨基酸残基，结果见Fig 4。维拉帕米与P-gp结合的活性氨基酸残基有TYR-310、GLN-347、PHE-983、MET-986、GLN-946等。维拉帕米具有很强的疏水性，能够与蛋白活性位点PHE-983形成很强的疏水相互作用；另外，维拉帕米与TYR-310、GLN-347、GLN-946、MET-986氨基酸残基形成4个氢键相互作用(Fig 4A)，且氢键距离较短(平均2.70Å)，结合能力强。岩白菜素与P-gp结合的活性氨基酸残基有GLN-347、GLU-875、GLN-990、ILE-868、GLN-946等。岩白菜素含有多个氢键供受体，能够与P-gp活性位点形成很强的氢键相互作用，如与GLN-347、GLU-875、GLN-990、ILE-868、GLN-946氨基酸残基形成5个氢键相互作用(Fig 4B)，且氢键距离较短(平均2.48Å)，结合能力强。维拉帕米和岩白菜素与P-gp结合的结合能分别为-8.09 kcal·mol-1和-8.23 kcal·mol-1，因此P-gp-岩白菜素复合物的稳定性强于P-gp-维拉帕米复合物。总之，岩白菜素与P-gp结合作用强且匹配度高，推测岩白菜素是一个潜在的P-gp底物。

Fig 4 Interaction between verapamil (A)，bergenin (B)，and P-gp

2.3 岩白菜素在MDCK-MDR1细胞单层模型的中的双向转运本试验条件下，MDCK-MDR1细胞单层模型电阻值>300 Ω·cm2，完整性良好；在MDCK-MDR1细胞单层模型透过良好的阳性对照咖啡因的Papp为(2.29±0.15)×10-5cm·s-1，透过差的阳性对照药阿替洛尔的Papp为(6.11±0.86)×10-7cm·s-1，符合标准操作规定值[10]。

岩白菜素从AP端到BL端的Papp值(Papp AP→BL)在10-6数量级或接近10-6数量级(Tab 1)，介于透过良好的阳性对照咖啡因和透过差的阳性对照阿替洛尔的数量级之间，因此判断岩白菜素为透BBB中等的化合物。岩白菜素转运的ER值>2.0(Tab 1)，提示外流占优势，推测其跨膜转运过程可能有外排蛋白的参与。在90 min内，岩白菜素的转运速率随浓度增加而增大(Fig 5)，给药浓度为20 μmol·L-1时，岩白菜素的转运量在120 min内随时间增加而增加(Fig 6)，说明岩白菜素的跨膜转运方式以浓度差驱动的被动扩散为主。

2.4 维拉帕米对岩白菜素双向转运的影响与岩白菜素单独给药比，岩白菜素与维拉帕米联合给药后岩白菜素的Papp AP→BL由1.07×10-6cm·s-1增大到3.47×10-6cm·s-1(P<0.01)，Papp BL→AP由4.63×10-6cm·s-1减小到3.42×10-6cm·s-1(P<

Fig 5 The transport rate of bergenin across MDCK-MDR1 cell monolayer as the function of concentration

Fig 6 The transport amount of bergenin across MDCK-MDR1

0.05)，ER值减小至0.98，接近于1(Tab 2)，表明岩白菜素是P-gp的底物。

3 讨论

一般来说，Papp AP→BL>3×10-6cm·s-1的化合物能有效透过BBB，Papp AP→BL<1×10-6cm·s-1的化合物较难透过BBB[13]。在MDCK-MDR1细胞单层模型中，岩白菜素(c=20 μmol·L-1)在90 min内转运的Papp AP→BL介于1×10-6cm·s-1和3×10-6cm·s-1之间，说明岩白菜素透BBB能力中等。根据ER值可初步判断化合物的转运机制：当ER值为1时，转运过程以被动扩散为主；当ER值>1.5时，转运过程可能存在外排蛋白参与；当ER值<0.5时，转运过程可能存在主动转运蛋白参与[14]。岩白菜素(c=20 μmol·L-1)在90 min内转运的ER值为4.32，初步判断其转运过程有外排蛋白参与。在岩白菜素的转运速率与浓度关系曲线中，外排方向的转运速率增长率随着浓度增加有减小的趋势，可能是由于浓度增加，岩白菜素与外排蛋白的结合饱和所致；在岩白菜素的转运量与时间关系曲线中，虽然随着转运时间增长膜两端的浓度差越来越小，但吸收方向的转运量增长率呈现增大趋势，可能依旧是受岩白菜素与外排蛋白结合饱和的影响。

Tab 1 Papp values and ER values for bergenin across

Tab 2 Effects of verapamil on bidirectional transport

GroupPappAP→BL(×10-6cm·s-1)PappBL→AP(×10-6cm·s-1)ERBergenin1.07±0.274.63±0.604.32Bergenin+Verapamil3.47±0.64∗∗3.42±0.40∗0.98

分子对接是一种药物虚拟筛选方法[12]，本研究通过分子对接发现维拉帕米和岩白菜素均通过分子间的氢键及疏水作用与P-gp结合，而岩白菜素与P-gp结合的活性氨基酸位点较多，因此岩白菜素与P-gp的结合能较大。维拉帕米本身是P-gp底物，属于竞争性P-gp抑制剂[15]，当岩白菜素和维拉帕米在MDCK-MDR1细胞单层模型中联合使用时，P-gp的功能被维拉帕米抑制，岩白菜素跨膜转运的Papp AP→BL明显增大(P<0.01)，Papp BL→AP明显减小(P<0.01)，ER值减小。因此，岩白菜素是P-gp底物，其透BBB跨膜转运过程除被动扩散外，还有P-gp的参与。

能透过BBB是治疗中枢神经系统疾病的药物发挥药效的关键，因此实现药物透BBB转运入脑成为药物开发亟待解决的难题。近些年来，国内外学者尝试通过联合用药的方式实现体外治疗效果优但难透过BBB药物的脑靶向给药。例如，川芎和天麻素联用，川芎通过抑制P-gp的表达来促进天麻素透BBB[16]；艾片和栀子联用，艾片通过打开细胞紧密连接促进栀子透BBB[17]。本研究已证明岩白菜素是P-gp底物，即竞争性P-gp抑制剂，提示在促进药物透BBB方面可对岩白菜素进行进一步的开发利用。