红豆树籽油制备工艺优化及脂肪酸类成分分析*

邢奇妹，周文娟，王春梅，欧余航，傅小伟，张琳婧，倪 林,3

（1.福建中医药大学附属第三人民医院，福建 福州 350008；2.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002；3.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

红豆树（Ormosia hosiei Hemsl.&E.H.Wilson）隶属于豆科红豆属植物[1]，又称鄂西红豆，主要分布于中国福建、陕西、云南、广东等地区[2]，其根、茎、叶和种子的提取物中含有多种活性成分[3]，均可入药，具有抗炎镇痛、活血化瘀等功效，民间用于治疗跌打损伤、风湿关节炎及不明原因的肿痛[4-8]，具有较高的药用价值。红豆树为福建省重点推广的经济树种，福建地区种植面积达400 hm2以上，植物资源丰富。课题组前期研究发现红豆树种子的含油率在9%以上，然而现有文献[9]仅分析了红豆树种子提取物的化学成分，其籽油组成成分未见报道。为进一步探究红豆树种子的出油率及其籽油脂肪酸成分组成，本研究采用响应面法优化石油醚加热回流提取红豆树籽油的提取工艺，并利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析鉴定红豆树籽油中的脂肪酸组成及含量，以期获得一种高效、简单的红豆树籽油的提取方法，并为红豆树药用价值的开发利用提供理论参考。

1 材料与仪器

1.1 材料 红豆树成熟种子采摘自福建省福州市晋安区北峰山区，经福建农林大学林学院邹双全教授鉴定为豆科（Leguminosae）红豆属（Ormosia）红豆树（Ormosia hosiei Hemsl.&E.H.Wilson）的种子。种子干燥后粉碎备用，留样保存于福建农林大学植物保护学院制药工程系。

1.2 试剂 正己烷（批号：20201021）、无水乙醇（批号：20200809）、石油醚（60～90 ℃）（批号：20200507）、乙醚（批号：20161109）、焦性没食子酸（批号：20160710）、三氟化硼（批号：20200330）、甲醇（批号：20200616）、盐酸（批号：20190419）、氢氧化钠（批号：20200901）均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器 ZL03348684型双列六孔电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；CPA225D型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；高速多功能粉碎机（永康市天琪盛世工贸有限公司）；HX-1050型恒温循环器（北京博医康实验仪器有限公司）；N-1100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；7890A-安捷伦气相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；CD-2560毛细管色谱柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）（北京迪马科技有限公司）。

2 方法

2.1 红豆树籽油的提取 精密称取2.000 g红豆树种子粉末置于250 mL圆底烧瓶中，以石油醚为提取溶剂，回流提取，提取液趁热抽滤，含有油脂的石油醚旋转蒸发后，称质量。红豆树籽油提取率按以下公式计算：提取率=（红豆树籽油质量/红豆树种子粉末质量）×100%。

2.2 红豆树籽油回流提取的单因素试验 以红豆树籽油提取率为评价指标，研究3个因素对红豆树籽油提取率的影响，每个因素设置5个水平（见表1），获得各条件下最佳提取工艺条件。

表1 单因素试验

2.3 响应面试验 根据单因素试验筛选出单因素的最佳工艺条件[10-11]，利用Design Expert 8.0.6软件对提取时间（X1）、提取温度（X2）和料液比（X3）设计三因素三水平的Box-Behnken试验（见表2），以籽油提取率（Y）为响应值，确定红豆树籽油提取的最佳工艺条件。通过响应面分析得到回流提取红豆树籽油的最佳工艺条件，并按照最佳工艺条件进行3次重复试验，以验证响应面法所得结果的可靠性。

表2 响应面试验因素水平

2.4 红豆树籽油脂肪酸成分分析

2.4.1 籽油前处理 称取优化条件下的红豆树籽油约0.1 g于圆底烧瓶，加入100 mg焦性没食子酸、2 mL 95%乙醇、10 mL 12 mol/L盐酸溶液，混匀后于70～80 ℃水浴中水解40 min。水解结束冷却至室温，加入10 mL 95%乙醇，用乙醚石油醚混合液（1∶1）萃取3次，取上层醚层置于烘箱中（50 ℃）干燥至恒重。干燥提取物装入离心管，加入2 mL 2%氢氧化钠甲醇溶液，置于85 ℃水浴30 min，后加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，继续水浴30 min。冷却至室温后，加入1 mL正己烷振荡萃取2 min后，静置1 h。取100 μL上清液用正己烷定容至1 mL，经0.45 μm滤膜过滤装入样品瓶，待气相色谱分析。

2.4.2 GC-MS分析条件 色谱柱为CD-2560（100 m×0.25 mm，0.20 μm），进样口温度为250 ℃；载气流速为0.5 mL/min；分流进样，分流比为10∶1；检测器为FID；检测器温度为250 ℃。升温程序：130 ℃保持5 min，以4 ℃/min的速率升温至240 ℃，保持30 min。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 提取时间 随着提取时间的延长，红豆树籽油提取率逐渐升高，提取时间为90 min时，提取率达到最大值为10.04%，提取时间继续延长，红豆树籽油提取率呈现下降趋势。这可能是因为提取时间延长，红豆树籽油溶出增加，提取率升高，达到最适提取时间后，提取时间延长导致红豆树籽油成分分解，提取率下降[12]。因此，最优回流提取时间为90 min。（见图1a）

3.1.2 提取温度 随着提取温度的升高，红豆树籽油提取率呈现先升高后下降的趋势，提取温度为70 ℃时，提取率达到最大值为9.98%。这可能是因为提取温度升高，反应速率增大，分子热运动加快，达到最适提取温度后，温度继续升高，籽油成分被破坏，发生降解，导致提取率下降[13]。因此，最优回流提取温度为70 ℃。（见图1b）

3.1.3 液料比 随着液料比的增加，红豆树籽油提取率呈现先升高后趋于平缓的趋势，液料比为20∶1（mL∶g）时，提取率达到最大值为9.84%。这可能是因为随着溶剂用量增加，红豆树籽油溶解量增加，提取率升高，达到最适溶剂用量时，籽油基本被溶解出来，再增加溶剂量提取率也不再增加[14]。因此，回流提取最优液料比为20∶1（mL∶g）。（见图1c）

图1 不同提取条件对提取率的影响

3.2 响应面分析

3.2.1 响应面回归模型建立与方差分析 以提取时间（X1）、提取温度（X2）和液料比（X3）3个因素为响应变量，以红豆树籽油提取率（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件设计三因素三水平的Box-Behnken试验，试验结果见表3。

表3 响应面设计及试验结果

经二次多项式回归拟合分析，得出红豆树籽油提取率的预测值对X1、X2和X3的二次多项式回归模型方程：Y=10.14+0.011X1-0.054X2+0.12X-0.00975X1X2-0.060X1X3+0.015X2X3-0.21X12-0.24X22-0.64X32。对回归模拟进行方差分析，结果见表4。

表4 回归方程方差分析

根据表4中的分析结果可知，红豆树籽油提取率的模型P=0.000 6＜0.01，表现为显著，失拟项P＞0.05，表现为不显著，说明该模型拟合成功。表4中一次项X2显著（P＜0.05），X1和X3不显著（P＞0.05），说明影响红豆树籽油提取率各因素的主次顺序为提取温度、液料比、提取时间；二次项X12、X22和X32均为极显著（P＜0.01）。

3.2.2 响应曲面图分析 红豆树籽油提取率的响应曲面图见图2。由图2可见，提取时间和液料比值交互作用的响应面曲面的坡度最大，等高线最密，说明提取时间和液料比的交互作用对红豆树籽油提取率的影响最为显著。图2（a）为提取时间和提取温度的交互作用对红豆树籽油提取率的影响，可以看出籽油提取率随提取时间和提取温度的增加呈现先上升后下降的趋势，在提取时间为90 min，提取温度为70 ℃附近出现最高籽油提取率。图2（b）为提取时间和液料比值的交互作用对红豆树籽油提取率的影响，可以看出籽油提取率随液料比值和提取时间的增加呈现先上升后下降的趋势，在提取时间为90 min，液料比为20∶1（mL∶g）附近出现最高籽油提取率。图2（c）为提取温度和液料比值的交互作用对红豆树籽油提取率的影响，可以看出籽油提取率随液料比和提取温度的增加呈现先上升后下降的趋势，在液料比20∶1（mL∶g），提取温度为70 ℃附近出现最高籽油提取率。

图2 各因素对提取率影响的响应曲面图

3.2.3 验证试验 结合模型拟合和回归方程进行分析，红豆树籽油的最佳提取条件为提取时间93.38min，提取温度71.27 ℃，液料比为20.05∶1（mL∶g），在该条件下红豆树籽油预测提取率为10.007%。为进一步验证响应面法所得结果的可靠性，同时考虑试验条件的可操作性，采用提取时间为93 min，提取温度为71 ℃，液料比为20∶1（mL∶g）进行3次重复试验，得到红豆树籽油提取率均值为10.01%，与预测值间的相对标准偏差为0.004%，两者无明显差异，说明响应面法优化的工艺条件可靠。

3.3 红豆树籽油脂肪酸成分分析结果 采用GB 5009.168—2016中的方法，通过GC-MS检测红豆树籽油中脂肪酸成分组成及各组分含量，气相色谱分析图见图3。

图3 红豆树籽油的气相色谱分析图

通过GC-MS检测红豆树籽油中脂肪酸成分组成及各组分含量，其结果见表5。红豆树籽油的脂肪酸总检出率为95.67%，检出的15种脂肪酸成分中，饱和脂肪酸含量为17.80%，不饱和脂肪酸含量为77.87%。脂肪酸中含量排名前三的成分为亚油酸、油酸、棕榈酸，其中亚油酸含量高达48.33%，可作为良好的亚油酸来源。亚油酸是人体必需的一种n-6系列多不饱和脂肪酸[15]，已有文献报道显示其具有抗黑色素[16]、抗肿瘤[17]、抗真菌[18]、蚜虫拒食作用[19]、杀螨[20]等活性。值得注意的是，红豆树籽油中含有0.77%的α-亚麻酸，其含量与橄榄油相当[21]；棕榈油酸含量（0.12%）高于大豆油（0.08%）；此外，红豆树籽油中含有0.48%的二十五碳烯酸。据研究显示α-亚麻酸具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗癌等生理功能[22]；棕榈油酸具有控制体质量、改善皮肤状况、预防动脉粥样硬化、改善代谢综合征与炎症、抑制破骨细胞形成等功能[23]；二十碳五烯酸具有降血脂、降低心血管疾病风险、抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、稳定斑块及稳定细胞膜等生物活性[24]，是重要的辅助治疗药物和保健品。红豆树籽油中高含量的不饱和脂肪酸，在日化行业、农业、医药业等行业具有良好的市场开发前景。

表5 红豆树籽油的脂肪酸组成及其含量

4 讨论

以石油醚为萃取溶剂，回流提取红豆树籽油，通过单因素试验和响应面分析得到回流提取红豆树籽油的最佳工艺条件为提取时间93.38 min，提取温度71.27 ℃，液料比20.05∶1，在该条件下红豆树籽油预测提取率为10.007%，验证试验得到的提取率与预测值无明显差异，响应面法优化的工艺条件可靠，可为红豆树资源利用及开发奠定基础。

经GC-MS分析表明，石油醚回流提取得到的红豆树籽油中含有15种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸含量较高，为77.88%，饱和脂肪酸含量为17.80%，含量排名前三的脂肪酸为亚油酸、油酸、棕榈酸，其中亚油酸的含量高达48.33%。