生物活性肽功能及其在酿酒中的研究进展

沈 阳，黄婉秋，罗 寒

（贵州茅台酒股份有限公司，贵州 仁怀 564500）

肽（peptide）是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物，是一类不同于蛋白质，但具有蛋白质性质与功能的小分子物质。根据其氨基酸数量，可以分为小肽和多肽。生物活性肽（bioactive peptide，BP）则是一类具有特殊生理调节功能的介于蛋白质和氨基酸之间的低分子聚合物，是由天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线形、环形结构的肽类总称。不同的多肽其功能和生物活性各有不同，目前对其研究的主要生理功能有抗氧化、调节血压、降低胆固醇、促进脂肪代谢、提高机体免疫力等。

随着时代的发展，人们对健康的关注度越来越高，酒作为人们喜爱的饮品，研究其所含有的保健养生功能性物质也逐渐成为热点。近年来，有不少研究者从酒中分离出具有生物活性功能的肽类物质，为健康饮酒，喝健康酒提供了科学指导。此外，在酿酒生产过程中，制酒的酒醅、酿酒产生的副产物酒糟以及酿造环境微生物中，也都有生物活性肽的存在。这些具有生物活性的肽类物质，对于酿酒的生产、风味和品质有着至关重要的影响，对于酿酒的健康发展也有着重要的研究价值。

1 多肽的生物活性与功能

1.1 抗氧化活性肽

抗氧化肽具有清除自由基、抑制脂质氧化以及与金属离子螯合等能力，具有抗氧化作用，对保护人体组织和器官免受自由基危害具有特定作用，通过抑制细胞氧化，来维持人体抗氧化防御系统的动态平衡，其抗氧化活性取决于它们提供氢的能力和结构的稳定性。

1.2 血管紧张素转化酶抑制肽

血管紧张素转化酶抑制肽（Angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptides，ACEIPs），是一类能够调节血压的生物活性肽的总称，又称为抗高血压肽。抗高血压肽能够阻碍血管紧张素转化酶（angiotensin-I converting enzyme，ACE）催化水解血管紧张素Ang I 成为血管紧张素Ang II，同时阻碍催化水解缓激肽（Bradykinin，BK）成为失活片段，从而起到降低血压的作用。相比于化学药物，使用天然具有降血压作用的生物活性肽来降血压，安全性更高。

1.3 抗菌肽

如今抗生素的滥用引发许多安全问题，细菌耐药性增强以及大量的药物残留迫使人们研究出安全无副作用的抗菌剂。抗菌肽对细菌的广谱高效杀菌活性，对部分病毒、真菌等的杀灭作用，以及其不易产生耐药性的优点，为抗菌新药的研发提供了方向，在医学上具有良好的应用前景。

1.4 免疫调节肽

免疫调节肽是具有免疫调节功能的生物活性肽，它能够增强人体的免疫功能，其包括寡肽、多肽和一些蛋白酶水解的混合肽。免疫调节肽可以作为一种新型食品原料，能够有效减少和调节与膳食相关的慢性疾病，提高机体免疫力。

1.5 多肽疫苗

多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗，例如乙型肝炎（乙肝）病毒（Hepatitis B Virus,HBV）多肽疫苗、人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）多肽疫苗、人类乳头瘤病毒（HPV）治疗性多肽疫苗等。多肽疫苗的优势在于安全、反应原性低等，是新一代疫苗研究的热点之一，随着技术手段的不断进步，越来越多的多肽疫苗被研发出来，并逐步开展临床前研究，在不久的将来造福人类。

2 酿酒与多肽的关系

有研究者对酿造生产中的肽类物质进行了研究，以探索酒类的功能性物质及酒糟等副产物中高附加值的功能性成分。酿造过程中产生的肽类物质，主要由酿酒原料以及酿造用曲生成。用于酿造酒的粮食(例如高粱、玉米等)中除了含有大量的淀粉外，还含有较丰富的蛋白质。在传统固态发酵酿造过程中，由于微生物的作用，会使蛋白质分解而产生很多多肽物质。在白酒蒸馏过程中，大分子肽的沸点很高，很难蒸馏出来，而小分子多肽（分子质量＜1000 U）则可能会溶解在乙醇-水体系中被蒸馏出来。酿造用曲中含有的大量微生物如酵母、霉菌和细菌等，这些菌体在酿造过程中的自溶也会产生大量的肽类物质。在酿酒过程中曲的添加量以及加工工艺等因素，对发酵样品中多肽物质的产生也有一定影响。

2.1 白酒中的多肽

近年来，有不少研究者从白酒中提取出多肽，并对其生物活性进行了研究。邓霞玲等采用HPLC-QTOF高分辨质谱仪从浓香型白酒（53%vol）、清香型白酒（53 %vol）、酱香型白酒（53 %vol）3 种白酒样品中检测到13 种环二肽化合物，并经过液相色谱仪与四级杆飞行时间质谱仪（LC-QTOF）分析后，得到了各环二肽的结构式。霍嘉颖等通过浓缩并结合液-液萃取从芝麻香型白酒原浆酒（乙醇体积分数65%）中分离纯化出一种三肽，并通过高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪（HPLC-Q-TOFMS）进行鉴定，确定其序列为Arg-Asn-His(RNH)，质量浓度为18.78 μg/L±0.34 μg/L；研究还发现RNH 通过增加细胞内抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶）的活力及细胞内还原性化合物谷胱甘肽浓度，来提高细胞的抗氧化能力，且其抗氧化能力呈浓度依赖性增加。吴继红等采用直接浓缩的方法从古井浓香型白酒和国井芝麻香型白酒中分离发现多肽，以液相色谱-飞行时间质谱联用仪（LC-ESI-QTOFMS）和合成标准品对其氨基酸序列进行鉴定，得到其氨基酸序列为Pro-His-Pro(PHP)；实验还发现其具有明显的抑制ACE 活性。霍嘉颖等在清香型草原王白酒中分离鉴定出了3 条多肽，采用液相色谱-飞行时间质谱联用仪（LC-ESIQTOF-MS）对其氨基酸序列进行了鉴定，分别为Lys-Val-Val-Ala(KVVA)，Val-Cys-Trp-Asn(VCWN)和Trp-ILe-Lys-Lys(WIKK)，并发现这3 条多肽都具有一定的ACE 抑制活性，且呈浓度依赖性增加，但它们之间ACE抑制活性的差异明显，研究者认为这种差异主要跟该多肽序列中是否存在疏水性氨基酸以及氨基酸所在的位置有关。

徐岩等在白酒中发现了由七肽和脂肪酸以内酯键结合形成的环状脂肽类化合物，并通过顶空固相微萃取气质联用技术（HS-SPME-GC-MS）和核磁共振（NMR）等方法发现其与白酒中风味化合物之间存在着独特的相互作用关系，对白酒风味有重要作用。进一步的研究表明，该环状脂肽类化合物为地衣素（Lichenysin），由利用高粱原料合成，在固态蒸馏过程中带入白酒。此外，研究者还从中发现了其他脂肽类化合物，包括丰原素（fengycin），枯草素（surfactin），芽孢菌霉素（bacillomycin）。这些脂肽类化合物都具有类似的化学结构。

2.2 酒醅、酒糟中多肽简介

为研究白酒中多肽的来源，孙金沅、姜云松等采用超滤、半制备型高效液相色谱等方法对古井贡酒酒醅水溶性提取物中的多肽进行分离纯化，并利用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪对所得多肽进行结构鉴定，发现了氨基酸序列分别为Lys-Gly-Pro(KGP)和Val-Pro-Asp(VPD)的2 种多肽，2 种多肽均表现出了很强的ABTS（2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基清除能力和氧化自由基吸收能力。此外，2 种多肽也表现出了ACE 抑制活性，KGP 与VPD 的半抑制浓度IC(50)分别为2.91 mmol/L 和2.11 mmol/L。其作用机制体现在可以显著降低细胞内活性氧（Reactive oxidative species,ROS）含量，提高过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）3种酶的活力以及还原型谷胱甘肽（GSH）的含量，同时也能够通过降低细胞内脂质过氧化水平，如丙二醛（MDA）的含量来保护细胞免受氧化损伤，并且两种多肽的抗氧化能力随着浓度的上升基本呈现一定的增强趋势。该研究为白酒中多肽类功能物质的溯源提供了一定的理论基础。

酿酒生产过程中，粮谷类作物通过加入酒曲、糖化酶等发酵剂，经蒸煮、糖化发酵、蒸馏等工序后产生的副产物酒糟，其成分包括未能发酵完全的淀粉、蛋白质、纤维素、有机酸、氨基酸、维生素、脂肪、酒用风味物质、酚类化合物、含氮化合物、杂环类化合物等，其中蛋白质含量较高，但大部分没有得到充分利用，从中提取蛋白、多肽或者氨基酸，可以成为制备其他生物材料的原材料。深入研究酒糟中附加值更高的功能性成分物质，对于拓宽酒糟的应用范围具有重要意义。魏冬等以白酒酒糟为研究对象，采用超滤、反相高效液相色谱法(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)分离制备酒糟中的水溶性多肽组分，并利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS)共分离鉴定出30 种多肽，包括6 种ACE抑制肽AAPK、KAGP、TVPK、YE、VPGK、TPF，2 种抗氧化肽VPSGK、LH 和1 种抑制紫外线引起红斑的功能短肽HP，表明白酒酒糟含有多种生物活性肽，该研究证明了利用酒糟提取功能性多肽的可行性，为白酒酒糟深加工或高附加值利用提供理论基础。

2.3 黄酒中的多肽简介

在中国黄酒中已有很多活性肽的报道，其作为黄酒里一种重要的功能性成分，不仅具有抗氧化功能，还可以降血压、降胆固醇。孟中法等对黄酒中游离氨基酸以及经过水解后的氨基酸进行测定，用水解后氨基酸含量减去游离氨基酸含量，粗略对黄酒中的肽含量进行估算，发现黄酒中肽含量可以达到13 mg/mL。冯瑞雪等通过大孔树脂吸附、凝胶色谱等方法多级分离纯化黄酒中活性肽组分，并探究各级分离肽组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用的影响。研究结果表明，黄酒多肽能显著抑制脂多糖LPS 诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7 分泌NO，对LPS 刺激的RAW264.7 细胞炎症有着保护作用，促使巨噬细胞发挥免疫作用，可见酒中的一些多肽物质有着提高人体免疫功能的作用。

王正元对黄酒中的多肽物质进行了深入研究，将黄酒中的肽类物质大体分为极性不同的四部分，鉴定出具有相对较高的胆固醇溶解抑制率和自由基清除率的峰p6 的氨基酸序列为四肽CGSP（Cys-Gly-Ser-Pro）。曹龙辉对广东客家黄酒中提取出来的抗氧化肽进行了研究，利用凝胶过滤层析从大孔树脂纯化物中分离出了4 个组分，并对各组分的抗氧化能力进行了测定，发现组分1 对ABTS自由基和DPPH 自由基的清除率分别为67.45 % ± 0.17 %和56.47 % ± 0.46 %，该实验从多肽的功能方面反映了广东客家黄酒的抗氧化能力。实验还对大孔树脂分离纯化抗氧化肽的条件进行了进一步的改良优化，确定了其分离纯化最佳的工艺条件，为多肽的提取工艺提供了借鉴。孟如杰通过对黄酒中抗氧化活性多肽的氨基酸组成进行分析，发现了它们都具有富含精氨酸、亮氨酸、赖氨酸等氨基酸的特点。戴军等通过基体辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF MS）联用仪，鉴定出了黄酒中含有4 种具有血管紧张素转换酶抑制活性的肽。张蓉真等在福建老酒中，也分离纯化出具有很强的血管紧张素转换酶抑制活性的肽。

随着肽的生理功能不断被发现，高肽含量的黄酒酿造逐渐成为研究的热点。蔡君等采用了酶法活性多肽生物发酵工艺酿造新型生物多肽黄酒，使发酵后的黄酒肽含量可达4 g/L 以上，强化了黄酒保健和养生的功能，研究还发现添加玉米肽不仅可以提高多肽黄酒的酿造效率，而且大大提高了黄酒的品质。赵文红等在黄酒发酵过程中，加入水解植物蛋白粉或麸皮酶解液，得到了多肽含量更高的黄酒，其多肽含量高达13.22 g/L，这种使黄酒中能富含多肽的酿造方法，有着制备工艺简单，原料成本低廉的特点。这些酿造工艺的研究为酿酒的健康发展提供了一定的参考。

2.4 葡萄酒中的多肽

在酿造酒中，人们对葡萄酒保健功能及其营养因子的研究较为深入，葡萄酒中的活性小肽是近年来研究的热点。在早些时候就已经有研究者对葡萄酒中的多肽物质进行了探索，发现葡萄酒中含有多种多肽物质。Pozo 等通过超滤和低压液相色谱分离，从白葡萄酒和红葡萄酒中分离得到具有血管紧张素转换酶抑制活性的多肽。有研究者对葡萄和葡萄酒中发现的内源性抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）进行了研究，发现在发酵进程中，酿酒酵母细胞内的Gex1基因对还原型GSH的产生起着重要的调控作用。酿酒酵母能够代谢并分泌出一部分还原型GSH，或是酵母吸收还原型GSH 前体物质来合成还原型GSH，从而使得酿酒过程中还原型GSH 含量发生变化。周元等研究了红葡萄酒陈酿前后肽的变化，发现在苹果酸-乳酸发酵和陈酿后，红葡萄酒中肽的分布有明显的变化，研究者认为这些肽来自酵母和葡萄本身，是红葡萄酒在苹果酸-乳酸发酵和橡木桶陈酿后口感和香气发生改变的重要原因。

3 展望

多肽具有多种多样的功能，在医学上具有深远的应用价值。自20 世纪以来，从陆地到海洋，从植物到微生物，研究者们从未停止过对多肽的探索。酿造食品中有芳香族类、内酯类、醇类、醛类、酮类、醚类、酸类等化合物，对食品的风味产生有重要的贡献；也有有机酸、糖、氨基酸、肽等非挥发性物质，对食品的风格特征起着重要作用。在白酒的酿造过程中，非挥发性物质能够与挥发性物质相互作用，调节挥发性物质的挥发性能，改变并协调香气结构，从而对放香强度与香气持久性产生调节作用。可以看出，酒中的肽类物质对于酿酒的品质有着直接或间接的影响。在白酒的生产过程当中，我们已经知道己酸菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等微生物的代谢对于白酒的香型和品质有着重要的影响。那么，研究白酒酿造过程中的微生物与多肽类物质的生成机制，将有着重要的意义。未来的研究当中，可以针对酿酒中多肽物质的分离、鉴定、生物活性功能，以及生成机制、溯源分析等方面入手，为酿酒的健康发展提供理论支持，也为今后酿酒的工艺研发提供一定参考。此外，还可以对酒糟中可能存在的高附加值肽类物质进行挖掘，使得酒糟能够再利用，从而减少对环境的污染，也为其他物质中多肽的研究提供科学的方法和研究思路。