UFLC法测定齐墩果酸粘附胶囊有效成分含量

2022-11-08刘丽君

化工与医药工程 2022年5期

刘丽君

（重庆市第九人民医院，重庆 400700）

齐墩果酸（简称OA），在食用植物和药用植物中分布广泛[1-2]，市售原料药的来源主要从含此类成分的中药材中提取生产；OA 具有丰富的药理作用[3]，临床可应用于多种疾病的防治，如：肝炎、“三高”、心脑血管疾病、神经系统疾病、癌症等[3-5]。而今市售齐墩果酸制剂较少，临床疗效没有充分发挥。另外，笔者通过查阅文献发现齐墩果酸含量检测方法主要是高效液相色谱法报道较多[4，6]，此方法检测时间一般在10 min 以上，耗时较长。因此，笔者研制了OA新粘附剂型，并建立超快速液相色谱法，缩短OA 粘附制剂中药物含量的测定时间，为其制剂的质量控制及其他类似成分的检测提供科学依据与借鉴。

1 材料

1.1 仪器

超快速液相色谱仪（Prominence UFLC 型，LC-20A，日本岛津公司），LC Solution 色谱工作站，超声波清洗机（CQ250A-TS，上海跃进医用光学机械厂）。

1.2 药物与试剂

齐墩果酸（中国食品药品检定研究院，批号：110709-201808）；齐墩果酸原料药（贵州益康制药有限公司，批号：20201105）、齐墩果酸粘附胶囊（含量：30 mg，批号：20200619，自制）；乙腈：色谱纯；水：纯净水；其余试剂为分析纯；药用乳糖、聚乙烯比咯烷酮K30（上海运宏化工辅料制剂技术有限公司）；羟丙甲基纤维素、卡伯姆（上海卡乐康公司）。

2 方法与结果

2.1 OA 粘附制剂的制备流程

精密称取卡波姆971：10 mg，HPMC K4M：40 mg，乳糖15 mg，将OA 原料药30mg 加入其中，过80 目筛后混匀，8%聚乙烯吡咯烷酮k30（100 mL的95%乙醇溶液中含PVPk 308 g）制作软材，20 目过筛制湿颗粒，45 ℃烘干后整粒，取95 mg 的颗粒装胶囊即可[7]。共制备1 000 颗胶囊剂。

2.2 色谱条件与系统适应性试验

（1）色谱柱：Onyx Monolithic C18 柱（规格：100 mm×4.6 mm；飞诺美公司）；

（2）以乙腈∶0.5%冰醋酸水溶液（80∶20）为流动相，等度洗脱；

（3）流速：1.0 mL/min；

（4）检测波长：210 nm；

（5）柱温：35 ℃；

（6）进样体积：10 μL；

（7）理论塔板数按齐墩果酸的含量峰计算，均超过3 000。

（8）保留时间约为4.5 min，用外标法进行定量。

2.3 溶液的配制

2.3.1 对照品溶液

（A）取OA 标准品，精密称定0.312 mg，置于量瓶中，加甲醇超声溶解，配制成浓度为0.031 2 mg/ mL 的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液（B）

取样品10 粒，倾出内容物，混匀，研细，精密称定30 mg 粉末于容量瓶中，加甲醇稀释，超声处理溶解，放冷滤过后，将续滤液1 mL 置于10 mL 容量瓶内，用甲醇稀释制得浓度为0.03 mg/mL 的供试品溶液。

2.3.3 阴性供试品溶液（C）

按2.1 节制备除齐墩果酸原料药外的阴性样品，并按2.3.2 节制成阴性样品溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性试验

将对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各注入超快速液相仪10 μL，按2.2 节进样分析。实验显示：在此条件下，供试品溶液与对照品溶液保留时间一致，阴性供试品溶液在相应位置无干扰。见图 1。

图1 UFLC 色谱图Fig.1 UFLC chromatogram

2.4.2 线性关系考察

精密称定OA 标准对照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，用甲醇超声充分溶解后冷却，制备浓度分别为0.001、0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg/mL 的溶液，在“2.2”条件下测定，记录纵坐标峰面积Y，横坐标药物浓度X，得回归方程：Y= 2 958 513.51X+1 448.55（r= 0.999 2）。实验显示：OA 在1～45 μg/ mL浓度范围内与其吸收度线性关系较好。

2.4.3 进样精密度实验

取2.3.1 节下同一样品，用不同浓度制备的A溶液，在2.2 节条件下，分别注入UFLC 液相色谱仪10 μL，持续测定6 次。结果显示，按OA 吸收峰统计，相对标准偏差RSD＜2.65%，提示仪器精密度较好。

2.4.4 耐用性考察

精密量取2.4.3 节的同一份供试品溶液，放置在室温条件，分别于0、3、6、9、12、18 h 时，按2.2节色谱方法，注入10 μL 检测，统计得OA 平均峰面积RSD＜1.7%。试验结果提示：供试品的样品溶液在18 h 内都比较稳定。

2.4.5 重复性考察

相同一个批次样品（批号：2020619），按2.3.2节操作，精密量取样品溶液，用UFLC 色谱仪吸取10 μL，检测其峰面积大小，计算OA 的平均含量是29.42 mg/粒，RSD＜1%，试验结果显示：本方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率考察

根据2.1 节不同成份配比，按照2.3.2 节方法，分别制备三种不同浓度梯度9 个平行样品溶液，在2.2节条件下，精确量取各10 μL，注入色谱仪检测，记录其特征吸收峰面积，代入2.4.2 节标准曲线方程计算OA 的浓度，统计加样回收率及相对标准偏差。实验显示，本处方辅助用料不影响OA 的测定，试验回收率在98.64%、100.64%、99.6%，而其相对标准偏差＜2%，表明此法精准度良好。如表1所示。

表1 OA 回收率测定结果Tab.1 OA recovery measurement results

2.5 样品的测定

取2.3.2 节10 份样品分别注入UFLC 色谱仪10 μL 进行含量测定分析，记录峰面积数据，以OA吸收主峰面积统计样品溶液中齐墩果酸的含量，结果如表2所示。

表2 样品含量测定结果（n=10）Tab.2 Sample content determination results（n=10）

3 讨论

3.1 波长的选择

在前期预实验中笔者对OA 进行了紫外扫描，发现OA 在吸收波长205～210 nm 范围内有较强反应；同时，流动相使用的溶剂也有末端紫外吸收，为减少溶剂带给齐墩果酸峰的影响，增加此试验的的灵敏度和可操作性，通过查阅有关研究[8-10]，笔者最终采用紫外210 nm 处的吸收波长作为实验标准。

3.2 色谱柱的筛选

为了达到所需的良好分离度，在前期中我们曾经采用Onyx Monolithic C18，Phenomenex Gemini C18 等型号色谱柱做对比试验，以柱效来评价优劣，结果表明用Onyx Monolithic C18 柱不论从系统稳定性、吸收峰形方面，还是从分离度好坏，齐墩果酸峰的理论塔板数方面，均表现较优。药物浓度与峰面积线性关系良好，精密度也符合测定要求。

3.3 流动相的确定

为了得到流动相的最佳组合，笔者又对乙腈或甲醇分别与不同浓度的甲酸铵、甲酸、磷酸等试剂进行筛选重组；结果，以乙腈与0.5%的冰醋酸配比80∶20，其吸收峰形状、分离度、响应速率等均能达到最优，且无杂质影响；同时，样品的测定周期较快，仅4.5 分钟就可以出峰。

3.4 方法耐受性的试验

通过改变色谱条件包括改变柱温、流速、流动相比例以及改变色谱柱等来考察系统适应性。结果发现在改变色谱条件后，OA 的对称因子与理论塔板数都变化不明显，说明该制剂的分析测试不需要很苛刻的条件，一般的分析方法即可。

3.5 齐墩果酸溶解度的考察

为了获得合适的助溶试剂，笔者对齐墩果酸的溶解性进一步进行评价[11]，通过试验发现OA 在甲醇、无水乙醇中极易溶解、在丙二醇、丙三醇中易溶，在水中因极难溶解而超出其检测限检测不到。因此，考察其溶解性质，对选择溶剂有重要指导作用，在对齐墩果酸进行检测时，可先用一定量甲醇助溶，再用溶出介质稀释至所需浓度。

3.6 齐墩果酸油/水分配系数（Papp）的测定

通过了解药物在水和有机溶剂中的溶解性能，有助于预测药物在体内的吸收活性，此检测试验对生物药剂学和制剂设计具有重要的指导意义[12]。因此，笔者采用正辛醇—水体系测定OA 的油水分配系数，结果表明随pH 值的增大系数变化不是特别明显，说明齐墩果酸在不同生理pH 条件下相对稳定。不会随着pH 值的改变而改变，由logPapp结果可知，其脂溶性较强。但是药物的吸收与P值的大小并不是简单地呈线性关系，因为它还受分子量大小、化合物结构及生物膜本身特性等诸多因素影响，实际的吸收情况还有待于进一步考察。

3.7 齐墩果酸稳定性的评价

笔者通过试验发现，OA 分别在pH 值为：1.0，3.0，4.5，6.8，7.8 数值下均较稳定，这可能与其化学结构有关，齐墩果酸为五环三萜类化合物，理化性质较稳定，几乎不受酸、碱、酶的破坏和影响[13]。人体胃肠道正常生理范围为胃：pH 值 1～3，十二指肠：pH 值 4～5，空肠和回肠：pH 值 6～7，大肠：pH 值7～8，由稳定性实验结果可知，OA 在胃肠道的生理pH 条件下均有很好的稳定性。在生理pH 下齐墩果酸的表观油/水分配系数Papp和logPapp值可用于预测胃肠道不同部位对药物的吸收情况，而胃肠道最佳的吸收logPapp值范围是0.5～2.0。试验研究结果表明，OA 在各生理pH 条件下的logPapp 值均大于2，说明其极性小，亲脂性强，跨膜转运吸收比较困难，这也是它胃肠道吸收较差的原因之一。