基于网络药理学探讨童心康合剂治疗小儿病毒性心肌炎的作用机制

宋惠霄，刘艳红，由笑蕊，李燕宁

小儿病毒性心肌炎是由病毒感染引起的，以局限性或弥漫性心肌炎性病变为主的疾病，各年龄段均可发病，以3～10岁多见，临床表现轻重不同，积极治疗后多数患儿预后良好，少数呈急性暴发性发病，病情危重，短时间内死亡或遗留顽固性心律失常等，严重影响儿童身心健康。中医学虽无“病毒性心肌炎”病名，根据病因及临床症状，该病归属于“心悸”“怔忡”“心痹”“胸痹”等范畴，中医药辨证施治疗效肯定。本研究基于网络药理学探讨童心康合剂治疗小儿毒瘀互结、气阴两虚型病毒性心肌炎的作用机制。

1 资料与方法

1.1 西医诊断标准 参照1999年9月全国小儿心肌炎、心肌病学术会议制定的小儿病毒性心肌炎诊断标准[1]。

1.2 中医辨证标准 小儿病毒性心肌炎毒瘀互结、气阴两虚证辨证标准参照《中药新药临床研究指导原则》[2]：神疲乏力，心悸，气短，面色苍白胸闷或胸痛，肢冷，多汗，等；主症：心悸，胸闷或胸痛，叹息；次症：乏力，气短，懒言，多汗，烦躁，咽痛(红)。具备主症1项及次症2项，可辨证为毒瘀互结、气阴两虚证。

1.3 病毒性心肌炎临床分型轻型标准 无明显自觉症状，偶发期前收缩或一过性心电图ST-T改变；患儿多表现为肢体无力、汗出过多、面色苍白、心悸、气短、胸闷、头晕等；检查可见面色苍白、口周发青、心尖部第一心音低钝，伴有期前收缩或Ⅰ度、Ⅱ度房室传导阻滞、轻度ST-T改变[2]。

1.4 病例纳入标准 符合小儿病毒性心肌炎西医诊断标准或临床诊断为病毒性心肌炎；符合中医小儿病毒性心肌炎毒瘀互结、气阴两虚证；符合小儿病毒性心肌炎临床分型轻型；年龄1～14岁；病程≤1个月；患儿监护人知情同意。

1.5 病例排除标准 不符合纳入标准或资料不全影响判断；合并严重原发疾病及精神病；本研究前3个月内参与过药物临床研究；白细胞计数≥12×109/L，中性粒细胞百分比>70%，疑似细菌感染的患儿；过敏体质(对2种以上食物、药物过敏)；根据接诊医生分析，易失去有效联系人；年龄<1岁或>14岁等。

1.6 一般资料 选取2015年1月—2018年11月山东中医药大学附属医院、山东中医药大学附属第二医院、济南市第三人民医院及济南市第四人民医院病毒性心肌炎患儿99例，随机分为童心康组(应用童心康合剂)和玉丹组(应用玉丹荣心丸)。童心康组48例，男25例，女23例；年龄1～10(4.87±2.80)岁；病程(14.85±3.00)d。玉丹组51例，男26例，女25例；年龄1～14(4.85±3.12)岁；病程(15.59±2.71)d。两组性别、年龄、病程比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.7 治疗方案 童心康合剂由炙黄芪、麦冬、丹参、板蓝根、炙甘草5味中药按3 ∶2∶2∶2∶1组成(山东省中医院西区制剂室生产，规格：每瓶100 mL)；用法：1～3岁4 mL，每日3次；4～6岁7 mL，每日3次；7～14岁10 mL，每日3次。玉丹荣心丸(上海玉丹药业厂生产，国药准字Z10970095)由玉竹、丹参、五味子、降香、苦参、大青叶、山楂、炙甘草8味中药组成；用法1～3岁2丸，每日3次；4～6岁3丸，每日3次；7～14岁4丸，每日3次。两种药物符合有效、同类、可比原则。两组以4周为1个疗程。

1.8 观察指标 观察两组治疗前后中医证候改善情况，主症、次症按无、轻、中、重计分，统计证候改善率及单项症状疗效；观察两组治疗前后肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心电图、心脏彩超及血尿便常规、肝肾功能；记录研究过程中两组不良事件发生情况。

1.9 疗效判定标准 中医疗效判定，根据公式：中医证候改善率=(治疗前总积分-治疗后总积分)/治疗前总积分×100%。临床治愈：中医证候积分减少>95%；显效：中医证候积分减少70%～95%；有效：中医证候积分减少30%～69%；无效：中医证候积分减少<30%。单项症状疗效判定，痊愈：症状消失；显效：症状明显好转(积分降低2个等级)；有效：症状好转(积分降低1个等级)；无效：治疗症状无变化或加重。

2 结 果

2.1 两组中医证候积分及CK-MB比较 治疗前，两组中医证候积分及CK-MB比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。治疗后，两组中医证候积分及CK-MB较治疗前降低(P<0.05)。详见表1。说明童心康合剂及玉丹荣心丸均可改善病毒性心肌炎患儿临床症状及CK-MB，疗效显著，且两组等效。

表1 两组中医证候积分及CK-MB比较(±s)

2.2 两组中医疗效比较 两组中医疗效比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。说明童心康合剂和玉丹荣心丸治疗小儿病毒性心肌炎疗效相当。

表2 两组中医疗效比较

2.3 两组治疗前后中医单项主要症状比较 3项中医单项主要症状样本量较少，不符合等级资料两样本比较秩和检验统计学方法的要求。两组3项主症改善情况仅用痊愈率比较，详见表3。说明玉丹荣心丸治疗心悸痊愈率略高于童心康合剂。

表3 两组治疗前后中医单项主要症状比较

2.4 两组治疗前后肝肾功能比较 两组治疗前后肝、肾功能主要指标均在正常范围内，故两者安全性值得肯定。

2.5 两组依从性情况比较 治疗期间，每次发放1周药物，1周后复诊，记录患儿症状体征，疗程4周，5例因未按要求服药中途剔除，研究结束时共纳入患儿99例。

2.6 不良反应 两组患儿均未发生严重不良反应。

3 基于网络药理学探讨童心康合剂治疗小儿病毒性心肌炎的作用机制

3.1 方法

3.1.1 获取童心康合剂活性成分及靶点 利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、TCMID数据库(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)和DrugBank数据库检索童心康合剂各药物含有的化学成分。在TCMID数据库检索麦冬、丹参、炙黄芪、炙甘草的有效成分；在TCMSP数据库检索丹参、板蓝根的有效成分，在DrugBank数据库检索丹参、炙甘草的有效成分。根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug-likeness，DL)进行筛选，设置阈值：OB≥30%、DL≥0.18。将获得的对应smile码输入到SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测靶点数据库中，得到与药物对应的靶点。从DrugBank数据库得到的有效成分需要将CAS号通过化源网查找分子式，再通过SwissTargetPrediction预测相关靶点。

3.1.2 病毒性心肌炎靶点 使用GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库，以疾病名称“病毒性心肌炎(viral myocarditis)”检索相关基因，GeneCards数据库中Relevance score评分越高，说明此基因对本病的研究价值越高。

3.1.3 童心康合剂治疗病毒性心肌炎靶点 利用Venny 2.1在线工具进行童心康合剂活性成分靶点和病毒性心肌炎相关靶点映射并绘制韦恩图，将两部分交集靶点作为童心康合剂治疗病毒性心肌炎靶点。

3.1.4 药物-成分-靶点网络构建 将单味药、活性成分、作用靶点信息导入Cytoscape绘制单味药-活性成分以及活性成分-作用靶点网络图，采用Cytoscape软件Merge功能绘制最终的单味药-活性成分-作用靶点网络，基于构建的网络分析童心康合剂治疗病毒性心肌炎的作用机制。

3.1.5 蛋白-蛋白互作网络(protein-protein interaction network，PPI network) 利用STRING平台将交集靶点构建PPI网络，组合分数阈值>0.4。应用Cytoscape软件绘制PPI网络，应用“Network Analyzer”功能对PPI网络进行拓扑结构分析，计算网络整体的节点度值分布(node degree distribution)和介数中心性(betweenness centrality)两个重要拓扑参数，以Degree和betweenness为参数分析童心康合剂治疗病毒性心肌炎的关键靶点，设置节点大小与颜色反映度值(Degree)大小，最终获得PPI网络。

3.1.6 童心康合剂治疗病毒性心肌炎靶点生物学功能富集分析 利用R语言{packages(“RSQLite”)}等多个工具包，将得到的交集基因进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，并进行可视化处理。

3.2 结果

3.2.1 童心康合剂活性成分及靶点分析 通过TCMID、TCMSP及DrugBank数据库对童心康合剂5种中药进行活性成分检索，其中丹参312个、板蓝根180个、麦冬55个、炙黄芪2个、炙甘草17个。对应1 095个靶点。

3.2.2 童心康合剂治疗病毒性心肌炎靶点分析 在GeneCards疾病靶标数据库中得到病毒性心肌炎相关基因靶点1 096个。绘制韦恩图得到童心康合剂治疗病毒性心肌炎靶点236个。详见图1。

图1 童心康合剂活性成分与病毒性心肌炎靶点的韦恩图

3.2.3 童心康合剂活性成分-作用靶点网络分析 采用Cytoscape软件的Merge功能绘制童心康合剂活性成分-作用靶点网络图，得到440个节点、4 363条边的网络，5味中药的199个活性成分作用于236个靶点上。详见图2。

图2 童心康合剂活性成分-作用靶点网络图

3.2.4 PPI网络分析 将韦恩图中236个童心康合剂治疗病毒性心肌炎的靶点导入STRING平台，得到PPI网络图，详见图3。输出(string_interactions.tsv)核心基因，使用R语言运行筛选出与疾病相关的30个基因，详见图4。连线数越多，说明该基因越处于核心位置，即该基因对疾病作用的意义越大。居前10位的分别是白细胞介素-6(IL-6)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、清蛋白(ALB)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤蛋白53(TP53)、表皮生长因子受体(EGFR)和胱天蛋白酶3(CASP3)。提示这些核心靶点可能是童心康合剂治疗病毒性心肌炎的主要途径。

图3 PPI网络图

图4 核心基因可视化分析图

3.2.5 富集信号通路分析 利用R语言安装{packages(“RSQLite”)}等工具包，将基因symbol转为基因ID，将得到的基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析筛选得到20个过程，包括与内肽酶活力改变、细胞因子受体结合、与蛋白丝氨酸激酶活性、磷酸酶绑定、蛋白二聚体活性等，绘制柱状图及气泡图，其中P值越小颜色越红，表明功能富集越大，详见图5、图6。利用R语言运行KEGG相关脚本，得到176条通路，包括与人类巨细胞病毒感染、流感病毒A感染、细胞凋亡(见图7)、C型凝集素受体信号通路、T细胞受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。

图5 GO功能富集分析柱状图

图6 GO功能富集分析气泡图

图7 细胞凋亡

4 讨 论

小儿病毒性心肌炎是由柯萨奇病毒、腺病毒、副流感病毒等感染引起的心肌炎性病变，轻者在查体中发现心律失常，患儿无明显不适，重者突然出现心源性休克、心脑综合征等危重症，甚则猝死，是严重威胁儿童身心健康的疾病。现代医学尚无特异性治疗方法，中医药在抗病毒、减轻心肌炎症、降低免疫反应、防治心肌纤维化等方面疗效显著，得到广大医患的认可。中医学中无此病名，根据临床表现归属于“胸痹”“心悸”“太息”“温病”等病证辨治。《小儿药证直诀》[3]记载五脏主病：“心主惊。实则叫哭发热，饮水而搐，虚则卧而悸动不安……心病，多叫哭，惊悸，手足动摇，发热饮水”。《儿科要略》记载：“心痛者曲身护其胸，大痛者爬床而搔席[4]”，发病情况与病毒性心肌炎发作时症状类似。李燕宁教授从医30余载，治疗小儿病毒性心肌炎颇有心得，认为本病病机为毒瘀互结、气阴两虚，此病理变化贯穿各个分期。急性期外感热毒从口鼻、鼻咽而入，毒伤心络，伤心体损心用，致气阴两虚，气阴两虚为本，邪毒侵袭为标，此期标实为主；迁延期毒瘀互结，以瘀为主，湿毒、痰毒、浊毒内生，虚实标本夹杂；慢性期病情迁延，气阴两虚明显，仍有毒瘀，且反复感受外毒，本虚为主，兼夹毒瘀。

李燕宁教授根据疾病病因病机提出解毒活血、益气养阴的治则，精心选药组成童心康合剂，临床疗效显著。李燕宁教授强调本病迁延期、慢性期均为急性期热毒未清所致，瘀血的产生与热毒密切相关，故清热解毒至关重要，提出“祛邪务尽”，防止病情进一步发展。本病急性期瘀血征象不明显，现代研究已证实急性期炎症细胞浸润，心肌坏死，心肌纤维溶解，心肌微循环障碍已存在，故李燕宁教授主张活血化瘀药在疾病初期即用，强调其应用贯穿始终，以防由瘀致毒，毒瘀互结，损伤正气。热毒侵袭致心之气阴两伤，如小儿先天禀赋不足、气阴亏虚，或病后调护不周致气阴损伤，更易感受热毒，故李燕宁教授临证早期应用大剂量炙黄芪，伍以麦冬，一则补心气、养心阴，扶正防复感外毒；二则气阴充足可托毒外出，防气虚血运不畅留而为瘀或阴虚血少涩而为瘀，加重病情恶化。

童心康合剂是由炙黄芪、麦冬、丹参、板蓝根、炙甘草5味中药按3∶2∶2∶2∶1组成。方中炙黄芪、麦冬为君，且炙黄芪使用量最大，两药合用培本益气养阴疗效显著。臣以丹参活血化瘀，佐以板蓝根清热解毒，使以炙甘草调和诸药，补脾益气复脉。

玉丹荣心丸是由上海玉丹药业厂生产，由玉竹、丹参、五味子、降香、苦参、大青叶、山楂、炙甘草8味中药组成，具有益气养阴、活血化瘀、清热解毒、强心复脉的功效。治疗气阴两虚或气阴两虚兼心脉瘀阻所致胸闷、心悸、气短、乏力等证，适用于病毒性心肌炎、心肌病、心肌损伤、心律失常、反复呼吸道感染、早期复极综合征等疾病的治疗。刘大为[5]观察23例病毒性心肌炎患儿，在基础治疗基础上加用玉丹荣心丸治疗，可明显改善患儿临床症状。葛安霞等[6]观察302例病毒性心肌炎患儿，观察组给予玉丹荣心丸治疗，对照组服用生脉饮，结果显示，观察组临床症状、体征改善，心肌酶及心电图恢复方面均优于对照组，表明玉丹荣心丸治疗病毒性心肌炎疗效显著，且为临床医生及病人所肯定，故本研究选择玉丹荣心丸作为对照组用药，99例患儿随机分组临床观察，结果童心康合剂与其同效，疗效显著。

病毒性心肌炎发病机制尚未明确，根据本研究结果与病毒感染、免疫反应、心肌纤维化、细胞凋亡等有关。网络药理学分析童心康合剂治疗病毒性心肌炎的核心靶点包括IL-6、AKT1、GAPDH、TNF、MAPK3、ALB、VEGFA、TP53、EGFR、CASP3等。其中IL-6、TNF是辅助性T细胞中介导炎症免疫应答的Th1细胞分泌的促炎细胞因子，富集分析显示T细胞受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路是童心康合剂治疗病毒性心肌炎的可能途径；T细胞受体在免疫突触形成中发挥着关键的作用，提供了T细胞和抗原呈递细胞之间的连接，T细胞激活促进了信号级联，通过调节细胞因子产生，细胞存活、增殖和分化决定细胞命运。有研究显示，IL-6单克隆抗体通过抑制Th17、Treg细胞数量和功能，实现对自身免疫性心肌炎的保护作用[7]。CD40信号与TNF受体相关因子结合，在动脉粥样硬化形成中发挥着重要作用[8]。

综上所述，抑制免疫反应是童心康合剂治疗病毒性心肌炎的可能机制。网络药理学提示童心康合剂可抗流感病毒A，抑制细胞凋亡，可见童心康合剂治疗病毒性心肌炎是多途径、多靶点的，体现了中医药治疗的优势，为进一步探讨童心康合剂治疗小儿病毒性心肌炎的分子机制提供了思路。