大熊猫自然保护区(瓦屋山、大相岭)潜在风险区域犬瘟热等病毒病的防控

燕 霞 苏小艳 马 锐 张东升 李 林 齐敦武 李运莉 岳婵娟 冯 娜 侯 蓉* 刘颂蕊*

(1.成都大熊猫繁育研究基地，四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，成都，610081；2.中国农业科学院，长春兽医研究所，长春，130122)

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)是我国特有的旗舰物种[1]，根据第4次野生大熊猫调查显示，全国野生大熊猫种群数量达1 864只[2]，截至2019年11月12日，全球圈养大熊猫数量已达600只[3]。尽管在中国政府和其他相关单位的保护下，大熊猫由濒危物种(EN)降级为易危(VU)，但其生存状态仍受到保护区周边家养犬的威胁。犬可以捕杀本地猎物，包括大型哺乳动物(Mammalia)，目前已发现其与数十种物种的灭绝有关[4]。自由放养的犬在单独行动时最多可移动30 km，栖息地可达28.5 km2[5]。与大多数熊科(Ursidae)动物一样，大熊猫在历史上曾被犬猎杀[6]。保护区工作人员观察到有犬在大熊猫保护区内活动，已经证实保护区内犬的活动会导致大熊猫栖息地破碎化，并严重干扰大熊猫的正常生活节律[7-8]。

保护区内大熊猫还易受到犬携带的犬瘟热(Canine distemper virus，CDV)等病毒性疾病的威胁[9]。早在1994年，在四川卧龙自然保护区大熊猫和周边犬的体内检测到了犬瘟热病毒和犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCV)抗体[10]。犬常携带CDV、细小病毒(Parvovirus，PV)、轮状病毒(Rotavirus，RV)和狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)，其中CDV、PV和RV能感染并导致大熊猫发病，甚至造成死亡。2014年12月—2015年4月，陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心的6只圈养大熊猫相继感染CDV而发病，其中5只治疗无效死亡[11]。成都和重庆两动物园的大熊猫血清学调查结果显示，大熊猫PV感染阳性率达50%，临床特征表现为出血性小肠炎[12]。王成东等[13]报道某基地在2001年有17只幼龄大熊猫(5～11月龄)先后感染RV，其中1只6月龄大熊猫在发病4 d后多器官功能衰竭死亡。2000—2003年，成都大熊猫繁育研究基地的大熊猫源RV病发病率为64.7%[14]。狂犬病为一种自然疫源性疫病，虽然目前未有大熊猫感染该病的报道，但该病为人畜共患病，一旦发病，病死率高达100%。

尽管犬对保护区内大熊猫等野生动物造成了巨大威胁，但全面捕捉和猎杀保护区内犬的实际意义不大：一方面放牧和守护家园需要，村民会继续购买犬饲养；另一方面犬可作为示警动物，有助于及时发现保护区内犬瘟热等病毒的流行情况，避免犬瘟热等病毒给保护区内大熊猫等野生动物带来毁灭性的危害。因此，在保护区周边潜在风险区域建立免疫隔离带是防控病毒病的一个行之有效的办法。本研究对大熊猫保护区潜在风险区域内犬的饲养情况(数量、饲养方式、体重和体长、性别)开展调查，为大熊猫自然保护区制定犬的管控措施提供基础数据；对犬携带的CDV、PV、RV和RABV进行监测以评估病毒对野生大熊猫和人类健康的影响。

1 材料与方法

1.1 样品来源

将与大熊猫自然保护区直线距离5 km内的村落定义为潜在风险区域。2019年5月21—24日，在2个自然保护区潜在风险区域的5个行政村(瓦屋山自然保护区的燕远村、黑山村、孔雀村和长河村；大相岭自然保护区的发展村)内采集78只犬口腔拭子和55只犬血样。

1.2 犬的饲养状态、体型统计及疫苗免疫

2019年5月21—24日，通过实地走访和问卷调查等方式向瓦屋山和大相岭大熊猫自然保护区潜在风险区域内的养犬村户了解犬的饲养方式(拴养或散养)，称量和测量犬的体重和身长，并记录。参考赵九洲等[15]的研究，定义体重≤4 kg、身长≤25 cm的犬为超小型犬；体重5～10 kg、身长26～40 cm的犬为小型犬；体重11～30 kg、身长41～60 cm的犬为中型犬；体重31～40 kg、身长61～70 cm的犬为大型犬。在村民自愿的原则下，免费为调查犬提供犬瘟热、腺病毒2型、副流感和细小病毒病四联活疫苗(以下简称犬瘟热四联苗，购自Zoetis公司)。

1.3 引物设计与合成

CDV引物的设计和合成参考张焕容等[16]的研究；PV选择通用引物[17]；从GenBank中下载CRV毒株A79-10/G3P[3](ID：EU708939.1)、CU-1(ID：EU708917.1)、K9(ID：EU708928.1)、RVA/Dog-tc/ITA/RV52-96/1996/G3P[3](ID：HQ661128.1)和GPRV毒株CH-1(ID：GU188284.1)的VP7蛋白全基因序列，通过DNAMAN 8分析各序列保守区域，利用Oligo7分别设计针对CRV和GPRV的2对引物(CRV和GPRV1)，并参考雷燕等[18]研究中的GPRV引物(GPRV2)作进一步验证(表1)。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 犬口腔拭子病毒的PCR扩增与检测

在生物安全柜内，将78份口腔拭子棉花头分别置于1.5 mL离心管内，加入700 μL无菌生理盐水，振荡30 s，12 000 r/min离心5 min后取液体按照试剂盒说明书提取病毒RNA和DNA(TaKaRa®病毒RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；AXYGEN®病毒DNA提取试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司)，将病毒RNA反转录成cDNA(TaKaRa®反转录试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)。cDNA产物和DNA产物于-20 ℃保存。PCR反应体系(25.0 μL)：模板DNA(或cDNA)2.0 μL，TaqMIX(2×)12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL。CDV扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸5 min。PV扩增条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸7 min。RV扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸7 min。取扩增产物在110 V条件下，1%琼脂糖凝胶电泳30 min，PCR阳性产物经Qiaquick PCR纯化试剂盒(德国QIAGEN有限公司)纯化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序结果在NCBI中比对，确定病毒种类。下载不同物种源的病毒基因组序列，使用MEGA 7中Neighbor-joining法构建系统发育进化树，分析阳性病毒序列的亲缘性。由于运用PCR检测RABV病原须在生物安全2级实验室进行，而本实验室未达标准，故本研究未进行RABV病原的PCR扩增与检测。

1.5 犬血清中狂犬病病毒中和抗体效价检测

调查犬在本次采集血样前均未进行RABV疫苗免疫，故检测调查犬血清中RABV的抗体水平能大致掌握调查犬RABV的既往感染史。在长春兽医研究所采用中和抗体法检测调查犬血清中RABV抗体效价。试验步骤参考杜晓鹏等[19]的研究，以犬血清RABV中和抗体效价≥0.50 IU/mL为阳性标准，达到或超过0.50 IU/mL，即对RABV具有有效的保护水平。

2 结果与分析

2.1 犬的饲养状态、体型统计及疫苗免疫结果

瓦屋山和大相岭大熊猫自然保护区潜在风险区域家养犬共计178只，其中51.7%(92/178)的犬为自由散养状态，48.3%(86/178)的犬为拴养。中型犬占47.2%(84/178)，小型犬占38.8%(69/178)，超小型犬和大型犬分别占10.7%(19/178)和3.3%(6/178)。中型犬和小型犬占比大，合计为86.0%；大相岭保护区潜在风险区域内犬的数量(119只)明显高于瓦屋山保护区(59只)(表2)，对其中158只犬进行了犬瘟热四联苗免疫，免疫率达88.8%(158/178)。

表2 大相岭和瓦屋山自然保护区潜在风险区域家养犬情况

2.2 犬口腔拭子CDV、PV和RV抗原检测结果

采用PCR技术对78份犬口腔拭子样本进行CDV、PV和RV抗原检测，结果显示：CDV和PV均为阴性；采用GPRV1引物扩增，阳性样品在743 bp出现目的条带(图1A)，采用GPRV2引物扩增，阳性样品在342 bp出现目的条带(图1B)，2种引物的阳性样品具有完全一致性，阳性率均为76.9%(60/78)。对所有GPRV1和GPRV2阳性样品的PCR产物回收测序后在NCBI中比对，发现产物与大熊猫源RV同源性最高。随机选取4份RV阳性样品构建系统发育进化树，分析结果显示：阳性RV与大熊猫源RV(GU188284.1)的亲缘性最高，与人源、犬源、猫源和猪源RV的亲缘性均较低(图2)。综上表明，犬携带的RV与大熊猫源RV同源率为100%，为大熊猫源RV。

图1 部分阳性轮状病毒样品的RT-PCR检测结果Fig.1 Detection of RT-PCR amplification for part of RV positive samples 注：M.DL5000 DNA Marker；1.生理盐水作为阴性对照；2.轮状病毒阳性对照；3～10.部分轮状病毒阳性样品 Note：M，DL5000 DNA Marker.l，Normal saline for negative control.2，RV positive control.3-10，Part of RV positive samples

图2 部分阳性轮状毒株序列发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree for part of RV positive isolates

2.3 犬血清中狂犬病病毒中和抗体效价结果

通过中和抗体法对犬血清中RABV抗体效价进行检测，结果显示55份血清中有7份中和抗体效价≥0.50 IU/mL，说明仅12.7%(7/55)的犬携带具有保护效力的抗体(表3)。

表3 犬血样中狂犬病病毒抗体效价

3 讨论

近年来，野生大熊猫的栖息地破碎化严重，部分大熊猫种群仍然面临生存风险[20]，而放牧家畜已成为大熊猫生境中最主要的干扰因素[21-23]。我国大熊猫保护区多地处中西部山区，由于历史和地理因素的限制，保护区内仍有村民居住，村民散养犬较多，几乎不进行防疫。犬因食物匮乏，自由觅食，活动地区常与野生大熊猫活动地区重叠[24]。进入保护区的犬有可能大幅减少大熊猫有效栖息地面积，Callan等[7]2020年对栗子坪自然保护区大熊猫栖息地普查，发现大多数大熊猫(86.0%)的活动地点都集中在偏远的“无犬区”；滕继荣等[8]对甘肃白水江国家级自然保护区林缘社区饲养犬只对大熊猫时空节律产生的影响展开调查，发现犬活动范围与大熊猫潜在栖息地存在28.2%的区域重叠，犬给大熊猫的活动节律带来显著影响。本研究发现，2个自然保护区潜在风险区域内的散养犬居多，以中型犬和雄犬为主，家养犬大多未做常规疫苗免疫。笔者通过红外相机发现犬进入保护区的现象，保护区潜在风险区域内犬对大熊猫等野生动物构成了威胁。大相岭保护区潜在风险区域内家养犬119只，比瓦屋山保护区多50.4%，以散养为主，由此推测大相岭自然保护区内大熊猫等野生动物受周围犬的干扰更大。

犬是杂食动物，不仅会捕杀野生动物，与野生动物竞争猎物，还可能将自身感染的疾病传播给野生动物。犬携带的常见病原，如CDV、PV和RV都可感染大熊猫。CDV的自然宿主从最初的犬科(Canidae)动物不断扩大至猫科(Felidae)、鬣狗科(Hyaenidae)、浣熊科(Procyonidae)、熊科和小熊猫科(Ailuridae)等[25-26]。1983年就有关于大熊猫死于CDV继发细菌病的报道[27]；李金中等[28]于1999年用特异性CDV引物从死亡大熊猫肝脏中检测出阳性样本，经基因序列对比分析进一步证实了大熊猫能够感染CDV。临床发现，大熊猫一旦感染上CDV，致死率几乎高达100%，已成为威胁大熊猫和小熊猫(Ailurusfulgens)种群数量的主要烈性传染病[29-30]。PV感染后可引发动物感染病毒性肠炎和幼崽心肌炎[31]，常见的有犬、狐、貂和猫等。据文献报道，有大熊猫因自然感染PV而发生肠炎的情况[12]。本试验所测样本表明，2019年5月瓦屋山和大相岭自然保护区潜在风险区域内的家养犬均未携带CDV和PV，由于未进行血清抗体检测，犬是否曾经感染过这2种病毒需进一步研究。

RV临床上以腹泻为特征，主要发生在幼犬中，成年犬一般不表现症状或症状轻微，目前尚无有效疫苗[32]。大熊猫源RV主要感染幼龄大熊猫(5～11月龄)，引起幼龄大熊猫腹泻甚至死亡。由于成年大熊猫感染RV多为隐性经过，并持久地向外界排毒，RV对环境因子和许多常见消毒剂有较强的抵抗力，导致某一地区发病后会连续发病[14]，这给大熊猫的繁育、健康及野化放归带来重大威胁。YAN等[33]前期对栗子坪自然保护区周边犬只开展疾病调查也发现犬的血清中含有RV抗体。本研究根据GenBank数据库中犬源RV和大熊猫源RV序列均设计了引物，以雷燕等[18]研究中的大熊猫源RV引物作了进一步验证，电泳和亲缘关系分析结果均表明保护区潜在风险区域内犬携带的RV并非犬源RV，而是大熊猫源RV，推测可能是散养犬进入大熊猫保护区内感染了大熊猫源RV，将病毒带回潜在风险区域内，造成了犬的大面积感染。由于缺少野生大熊猫相关样本，这种推测无法得到验证。众所周知，野生大熊猫为独居动物，自身携带的病毒在大熊猫间相互传染的概率相对较低，但是犬为群居动物，在保护区内大范围活动，由犬携带的病毒可在野生大熊猫种群中扩散，威胁野生大熊猫种群的健康，这一问题需要引起关注。保护区潜在风险区域内的家养犬有可能进一步将自身携带的RV回传给大熊猫，因此，建立免疫隔离带和劝导村民拴养犬，对保障大熊猫种群健康具有十分重要的意义。

狂犬病是RABV所致的急性传染病，由犬传播，目前尚缺乏有效的治疗手段，人患狂犬病后的病死率近100%，故应加强预防措施[34]。本次调查发现，部分犬(12.7%)具有有效的狂犬病保护性抗体，而当地这些犬基本上未接种过狂犬病疫苗，说明该地区的犬曾接触过RABV。虽暂未发现大熊猫感染狂犬病的病例，但其作为一种人兽共患性传染病，威胁了当地居民和犬科动物的健康，应倡导村民对家养犬接种狂犬病疫苗，减低患病及传染风险。

犬接种疫苗可有效预防犬瘟热等疾病，目前市场上成熟的犬用疫苗产品很多，但尚无大熊猫用疫苗产品。本研究在村民自愿的前提下，对保护区潜在风险区域内的158只家养犬接种了犬瘟热四联苗，在大熊猫自然保护区潜在风险区域建立犬瘟热和细小病毒的免疫隔离带。刘小斌等[24]通过接种疫苗在佛坪大熊猫保护区建立犬瘟热免疫隔离带，取得了较好的效果。本研究会在后期持续调查免疫犬的抗体水平，并每年进行疫苗免疫接种。

综上所述，野生大熊猫在人类等相关活动的影响下，生存空间逐步缩小且面临各种疾病的威胁，需定时对保护区周边犬开展流行病学调查、疫苗免疫和建立免疫隔离带，可有效阻断犬瘟热等疾病的传播。同时，联系当地保护区管理局，加强犬的科学饲养宣传，减轻对大熊猫等野生动物的干扰和影响。

致谢：感谢荥经县大相岭自然保护区管理局和大熊猫国家公园眉山管理分局工作人员及地方政府工作人员对本研究开展犬调查、犬免疫接种及采样等工作的支持和帮助；感谢保护区周边养犬村民的大力配合；感谢本部门同事向波、陈丽和李雯静进行文明养犬的科普宣传工作。