血清lncRNA DLX6-AS1 Actinin-4表达与宫颈癌术后复发及预后的关系

刘贵珍，杨瑞红，李宝连

(1.山西省吕梁市人民医院妇科，山西 吕梁 033000 2.山西省肿瘤医院分子生物室，山西 太原 030000)

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤。我国每年新发现病例达13万例，死亡达5.3万例，严重威胁我国女性身体健康[1]。近年来随着宫颈脱落细胞学、HPV及阴道镜等筛查的普及，使得许多早期宫颈癌患者得到早期诊治。对于早期宫颈癌患者主要采用宫颈癌根治术治疗，但部分患者术后仍会发生肿瘤复发的现象，对于术后复发的患者再次治疗的疗效较差，5年生存率仅13%[2]。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)DLX6-AS1编码基因位于人类7号染色体。据报道，lncRNA DLX6-AS1在膀胱癌、乳腺癌等肿瘤中发挥致癌作用，其通过激活RAS/RAF信号通路，促进血管内皮生长因子A的表达，促进肿瘤血管生成及转移[3]。辅肌动蛋白4(Actinin-4)是ACTN家族成员，其与丝状肌动蛋白交联，以维持细胞骨架的完整性并控制细胞运动。研究表明，Actinin-4在乳腺癌、前列腺癌多种癌症中表达显著升高，其表达上调能够降低细胞之间粘附性，增强肿瘤细胞增殖和侵袭、转移[4,5]。本研究通过研究宫颈癌患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表达，分析两者表达与临床病理特征及术后复发预后的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料:选取自2016年2月至2018年2月期间行宫颈癌根治术的120例宫颈癌患者为研究对象(宫颈癌组)。纳入标准：①初次诊治，既往无抗肿瘤治疗；②接受宫颈癌根治术治疗的ⅠA～ⅡA期宫颈癌者；③病理检查确诊为宫颈癌；④临床病理资料及随访完整。排除标准：①伴有其他恶性肿瘤者；②患者不能配合相关检查及治疗；③合并严重心肺肝肾脏器功能衰竭者，④中途失访丢失者。年龄25～67岁，平均(44.35±5.18)岁；肿瘤直径：≤4cm者73例，>4cm者47例；病理类型：鳞癌85例，腺癌35例；病理分级：高中分化82例，低分化38例；FIGO分期：IA～IB期78例，ⅡA期42例；间质浸润深度：≤1/2者45例，>1/2者75例；淋巴结转移：无97例，有23例。以同期健康体检的50例健康人为对照组，年龄24～64岁，平均(43.98±5.20)岁。两组年龄之间无明显差异(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准,患者及其家属已签署知情同意书。

1.2方 法

1.2.1血清lncRNA DLX6-AS1表达检测 取宫颈癌患者及对照组查体时清晨空腹静脉血5mL，3000rpm/min离心10min(离心半径10cm)，保留上层血清。采用实时荧光定量PCR检测血清lncRNA DLX6-AS1表达水平。仪器为ABI7500型荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)。采用Trizol试剂提取血清中总RNA，经Narodrp1000鉴定浓度及纯度，OD260/OD280=1.8～2.1之间。将总RNA反转录为cDNA后进行荧光定量PCR。以GAPDH为内参基因,反应条件:94℃ 5 s 、58 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s、45个循环,引物购于上海生工公司。 lncRNA DLX6-AS1上游序列为5’-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3’，下游序列为5’-ATTGACATGTTAGTGCCCTT-3’；GAPDH上游序列为5’- GAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3’，下游序列为5’-ATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCT-3’。采用2-△△CT法计算lncRNA DLX6-AS1的相对表达水平。依据lncRNA DLX6-AS1的相对表达量平均数2.24将患者分为lncRNA DLX6-AS1高表达组、lncRNA DLX6-AS1低表达组。

1.2.2血清中Actinin-4表达水平检测:采用酶联免疫吸附实验检测血清Actinin-4表达水平。酶联免疫吸附试剂盒购自上海联迈生物公司。简要步骤：反应板设标准品孔和样本孔，每孔加入对应的标准品和样本50μL，分别加入酶结合物100μL，混匀后封板膜封板，37℃恒温箱孵育30min。加入150μL洗涤液反复洗涤5次，分别加底物A液、B液各50μL，混匀后封板膜封板，37℃恒温箱孵育15min，每孔加终止液50μL，充分混匀。用酶标仪测定各孔OD450nm值。根据标准品浓度的OD值，对应计算每孔样品的浓度值。根据Actinin-4表达平均数48.95pg/mL，将患者分为Actinin-4高表达组、Actinin-4低表达组。

1.2.3随访:以宫颈癌患者出院后开始进行随访，以电话或门诊方式进行随访，连续随访3年，第一年每三个月随访一次，第2、3年每六个月进行一次随访,以随访过程中是否出现复发为终点,随访终点为肿瘤复发或随访结束。根据复发时间计算患者的无进展生存时间。依据是否复发将研究对象分为复发组(19例)和无复发组(101例)两组。

2 结 果

2.1宫颈癌组与对照组患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表达比较:宫颈癌组血清lncRNA DLX6-AS1相对表达量、Actinin-4水平分别为(2.24±0.37)、(48.95 ± 11.65)pg/mL，对照组分别为(1.31±0.25)、(30.84 ± 7.16)pg/mL。与对照组相比，宫颈癌组血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表达显著升高，差异均有统计学意义(t=16.278、15.844，P=0.000、0.000)。

2.2宫颈癌组血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表达的相关性分析:Pearson相关分析结果，宫颈癌组血清lncRNA DLX6-AS1与Actinin-4的表达呈显著正相关性(r=0.560、P=0.000)。

2.3宫颈癌组血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表达与临床病理特征的关系:不同FIGO分期、病理分级、间质浸润深度及淋巴结转移患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表达差异具有统计学意义(P<0.05)，而不同年龄、肿瘤直径及病理类型之间，差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 宫颈癌血清lncRNA DLX6-AS1 Actinin-4表达与临床病理特征的关系

2.4宫颈癌组血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表达对宫颈癌根治术后复发的影响:120例宫颈癌患者随访过程中，随访期间无失访，复发19例，3年复发率为15.83%(19/120)。lncRNA DLX6-AS1高表达组3年无进展生存率为75.86%(44/58)，显著低于低表达组91.94%(57/62)(Log-rank χ2=4.846，P=0.000)；lncRNA DLX6-AS1高表达组无进展生存时间平均为(32.75±1.29)个月，明显短于低表达组(34.14±1.47)个月(t=5.500，P=0.000)。Actinin-4高表达组3年无进展生存率为72.88%(43/59)，显著低于低表达组95.08%(58/61)(Log-rank χ2=5.124，P=0.000)；Actinin-4高表达组无进展生存时间平均为(32.68±1.56)个月，明显短于低表达组(34.14±1.60)个月(t=5.056，P=0.000)，见图1。

图1 ROC曲线分析血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表达对宫颈癌根治术后复发的影响

2.5单因素及多因素COX回归分析影响宫颈癌根治术后复发的因素:单因素分析结果，无复发组与复发组之间在间质浸润深度、淋巴结转移、病理分级、FIGO分期、lncRNA DLX6-AS1及Actinin-4之间(均P<0.05)，两组在年龄、肿瘤直径、病理类型之间无明显差异(均P>0.05)。见表2。以是否发生复发为因变量(t=时间，1=复发，0=无复发)，将单因素分析中有统计学意义的因素包括间质浸润深度(赋值：1=>1/2，0=≤1/2)、淋巴结转移(赋值：1=有，0=无)、病理分级(赋值：1=低分化，0=高中分化)、FIGO分期(赋值：1=ⅡA，0=ⅠA～ⅠB)、lncRNA DLX6-AS1(赋值：1=高表达，0=低表达)及Actinin-4(赋值：1=高表达，0=低表达)纳入多因素COX比例回归模型，结果显示,病理分级低分化、FIGO分期ⅡA期、lncRNA DLX6-AS1高表达﹑Actinin-4高表达是影响宫颈癌根治术术后复发的独立危险因素(均P<0.05)。见表3。

表2 单因素分析影响宫颈癌根治术后复发的因素

表3 多因素COX回归分析影响宫颈癌根治术后复发的危险因素

3 讨 论

目前对于早期宫颈癌以手术治疗为主，宫颈癌根治性术是主要的术式。研究表明，对于ⅠB～ⅡA的宫颈癌患者，宫颈癌根治治术术后患者的5年生存率可达75%以上，但仍有部分患者术后出现复发[6]。影响宫颈癌根治术术后复发的因素包括肿瘤分期、分级等临床病理因素，但临床中发现，宫颈癌具有较大的异质性，即使相同临床分期的患者也具有不同的复发倾向。lncRNA是一种长度超过200个核苷酸的转录物，可作为癌基因或抑制基因，参与人类肿瘤、炎症及免疫等疾病的病理生理学过程。国内有学者发现，宫颈癌患者血清LncRNA SRA水平与患者的临床预后关系密切，可作为评估宫颈癌预后的生物标志物[7]。深入研究宫颈癌发生发展的机制，寻找能够预测术后复发的血清LncRNA肿瘤标志物，能够辅助临床医师对高危患者予以积极治疗及密切随访，以降低术后复发率，改善患者临床预后。

LncRNA DLX6-AS1是近年来发现的具有肿瘤促进作用的新的LncRNA分子，在膀胱癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中均参与促进肿瘤细胞的恶性增殖及转移等恶性生物学过程，可能是新的肿瘤诊断及生物治疗的靶点[3]。本研究中，宫颈癌患者血清lncRNA DLX6-AS1表达明显升高，并且其表达与FIGO分期、病理分级、间质浸润深度及淋巴结转移有关，提示lncRNA DLX6-AS1可能参与宫颈癌的发生发展过程。宫颈癌中表达上调的机制可能与转录调控有关。有学者发现，肿瘤中H3组蛋白第4位赖氨酸一甲基化能够显著激活lncRNA DLX6-AS1基因的转录及表达，进而促进肿瘤增殖及转移，并诱导肿瘤对顺铂耐药性形成[8]。此外，lncRNA DLX6-AS1能够作为内源性竞争性RNA，抑制微小RNA-16-5p，导致下游环腺苷酸调节的磷酸化蛋白19过度激活，促进肿瘤的恶性增殖及转移[9]，而在宫颈癌细胞中敲除lncRNA DLX6-AS1的表达后，其下游癌基因FUS表达显著受到抑制，导致肿瘤细胞的增殖及侵袭能力降低[10]。因此，lncRNA DLX6-AS1表达升高参与促进宫颈癌的肿瘤进展。本研究发现，血清lncRNA DLX6-AS1高表达患者无进展生存率明显较低，并且lncRNA DLX6-AS1高表达是影响宫颈癌患者术后复发的独立危险因素，表明检测血清lncRNA DLX6-AS1表达有助于判断宫颈癌根治术后复发预后，是一种新的预后判断的肿瘤标志物。宫颈癌术后复发与肿瘤细胞的血管及淋巴结转移关系密切。研究表明，lncRNA DLX6-AS1的表达升高能够通过诱导糖基转移酶LARGE的甲基化，沉默LARGE的基因表达，促进肿瘤细胞的淋巴转移[11]。

Actinin-4是ACTN家族成员，作为一种细胞骨架蛋白，其在N端有一个肌动蛋白结合域，能与肌动蛋白交联，维持细胞结构及参与细胞运动调节。近年来发现，在乳腺癌中Actinin-4作为一种促癌基因，通过激活Akt/GSK3β信号通路，促进肿瘤细胞的侵袭及转移，是新的肿瘤标志物[5]。本研究中，宫颈癌患者血清Actinin-4水平明显高于对照组，提示Actinin-4可能参与宫颈癌的肿瘤发生。分析其机制，可能与宫颈癌中Actinin-4蛋白稳定性增加有关。研究表明，宫颈癌肿瘤细胞中Na+/H+交换调节因子1表达显著下调，导致其对Actinin-4蛋白泛素化能力降低，Actinin-4蛋白经蛋白酶体途径降解减少，进而激活下游Wnt通路，促进宫颈癌细胞的增殖及转移[12]。尚有研究表明，宫颈癌中Actinin-4基因启动子存在扩增的现象，导致Actinin-4蛋白过度表达激活，导致患者血清Actinin-4水平升高[13]。本研究中，血清Actinin-4表达与FIGO分期、病理分级、间质浸润深度及淋巴结转移有关，提示Actinin-4的表达升高可能参与宫颈癌的发生发展。有学者研究发现，宫颈癌肿瘤细胞中Actinin-4能够促进癌细胞干性表型转化，不仅促进肿瘤细胞的上皮间质转化，导致肿瘤侵袭转移能力增强，还能通过结合ATP结合盒家族G2，促进肿瘤细胞化疗耐药性的形成[14]。本研究中，血清Actinin-4高表达患者无进展生存率明显较低，并且血清Actinin-4高表达是影响宫颈癌患者术后复发的独立危险因素，表明检测血清Actinin-4水平有助于评估宫颈癌患者术后的复发风险，是一种新的预后相关血清标志物。目前临床上宫颈癌的血清标志物包括鳞状细胞癌抗原，糖类抗原125及癌胚抗原等。但不同临床研究由于研究对象，分期分级等因素，难以取得一致的结果，因而目前尚无一种血清标志物用于宫颈癌术后预后的判断。临床上部分早期宫颈癌患者根治性手术后复发与切除区域外仍有肿瘤的微转移有关，而目前影像学等检查并不能早期发现，lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4作为新的血清标志物，有助于反映宫颈癌根治术后复发的风险，临床医生对高风险复发的患者提供个性化的辅助化疗，减少术后复发的发生。

本研究发现，宫颈癌血清lncRNA DLX6-AS1与Actinin-4的表达呈显著正相关，提示两者可能共同参与宫颈癌肿瘤发生发展过程。目前其机制尚不清楚。研究发现，lncRNA DLX6-AS1能够作为分子海绵结合并抑制微小RNA-142-3p的表达，促进肿瘤细胞干性表型的维持，而肿瘤中微小RNA-142-3p的表达降低导致其下游的Actinin-4表达异常升高，促进肿瘤进展[15]。但宫颈癌中是否存在lncRNA DLX6-AS1对Actinin-4的表达调控，有待今后进行实验研究进一步探索。

综上所述,宫颈癌患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表达升高，两者的表达与FIGO分期、病理分级、间质浸润深度及淋巴结转移有关，是影响宫颈癌术后复发的独立危险因素,可能成为宫颈癌病情及复发预后评估的血清肿瘤标志物。本研究的不足之处在于为单中心研究，样本量有限，有待今后设计多中心前瞻性临床研究进一步验证本研究结论，并对两者的临床应用价值进行深入探讨。