烟草根际细菌YF-6的分离筛选与生测

安依凡， 曹洋， 毛文林， 何佶弦， 杨洋， 李斌

(1.西北农林科技大学植物保护学院 植物病毒/资源微生物实验室，陕西 杨凌 712100；2.四川省烟草公司广元市公司，四川 广元 628017； 3.四川省烟草公司宜宾市公司，四川 宜宾 644000；4.中国烟草总公司四川省公司，四川 成都 610000)

烟草赤星病是烟叶成熟期病害，1892年在美国首次发现[1]，其病原为链格孢菌，属半知菌亚门丝孢纲丝孢目链格孢属。该属真菌的分生孢子梗呈淡褐色至褐色，由菌丝上生出，与菌丝无明显区别[2]，其分生孢子最适宜在烟叶表面萌发，易从叶毛基部细胞、叶缘和虫咬伤口处侵入，有时也可从气孔侵入[3]。

微生物拮抗作用是指一种微生物在其生命过程中，通过产生某些代谢产物而改变其他微生物的生存环境，从而使其他微生物的生长受到抑制，甚至致死的现象[4]。烟草赤星病孢子主要靠风传播，对于用微生物菌剂防止烟草赤星病菌侵染，需要配合剂型为可喷雾水剂的叶面喷雾拮抗菌剂来阻挡病菌侵染。

一般来讲，在植物根系分泌物中，微生物的营养物质对有益菌和病菌都有吸引作用。利用微生物抑制病菌生长的一个思路是，首先找到植物根系分泌物中营养物质所吸引的有益菌，比如某些芽孢杆菌，然后将其培养为数量占优的头领微生物[5]，再利用与植物和谐生长的该芽孢杆菌的杀菌和占位效应来抑制病菌。王丽珍[6]从重庆市烟区烟草根际土壤中筛选出抗赤星病的生防菌巨大芽孢杆菌B-43-6；李安娜等[7]从山东烟田烟草根际和根围土壤中筛选出抗赤星病的芽孢杆菌B102；张芬芬等[8]从甜罗勒根际筛选出对烟草赤星病菌具有抑制作用的枯草芽孢杆菌LL-16；王静等[9]从烟草根际土壤中筛选出抗赤星病的生防菌[10]短小芽孢杆菌AR03。本研究进行了拮抗赤星病菌的烟草根际细菌筛选，旨在判断拮抗细菌YF-6是否具有研发烟草赤星病生防可喷雾水剂的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年8月，在陕西省汉中市南郑县新集镇烟区和四川省广元市剑阁县普安镇烟区采集健壮烟株根际土壤样本。供试菌株有烟草赤星(Alternariaalternata)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、苹果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides)、棉花枯萎(Fusariumoxysporum)、玉米大斑(Exserohilumturcicum)、枯草芽孢杆菌1号(Bacillussubtilis1)，均由西北农林科技大学植物病毒和资源微生物试验室保存和提供，采用LB(luria-bertani)培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。

1.2 方法

1.2.1 根际细菌的分离与菌株制作

土样采集。找到长势旺盛、无病虫害的烟草植株，从茎秆底部由中心向四周刨开土壤，使根系露出，收集根系周围小颗粒的土壤，剪下部分根系，将土壤和根系装入自封袋中。

根际细菌的分离。称取土壤样本10 g，倒入装有90 mL无菌水的锥形瓶中[11]，于200 r·min-1振荡20 min[12]，60 ℃水浴30 min，制成1∶10的土壤稀释液，用移液枪吸取1 mL，加入9 mL无菌水充分振荡，制成1∶102的土壤稀释液。依此类推，分别制成1∶103、1∶104、1∶105、1∶106的土壤稀释液。每个浓度的土壤稀释液摇匀后用移液枪移取250 μL至LB平板上，用玻璃涂布器画圈涂匀封口，在26 ℃恒温箱中培养4 d。

挑取形态、颜色等特征不同的菌落画线于提前制作好的LB斜面，每个不同的菌落画线3个斜面，编号后在26 ℃恒温箱中培养3 d，待细菌沿斜面画线完全生长，即完成菌株制作。

1.2.2 从根际细菌中筛选拮抗细菌

初筛。接种烟草赤星病菌至PDA平板，待其长满后，用5 mm打孔器打孔，将菌饼移到对峙用PDA平板中央。对分离到的细菌按编号顺序，每3个菌依次接种在距离病菌3 cm的3个对角上，另1个对角作为空白对照，重复2组。于26 ℃恒温箱中培养5 d，根据抑菌带宽度确定拮抗程度，选取拮抗效果好的菌株，视为拮抗细菌。

复筛。将5 mm烟草赤星病菌的菌饼接种至PDA平板中央，对初筛选择的拮抗细菌，单菌接种在距离病菌3 cm的两点最远的对称位置，重复2组。26 ℃恒温培养箱中培养12 d，测量5 d样本和12 d样本的对峙试验数据[13]。筛选效果最好的1株拮抗细菌，对其12 d样本进行显微镜观察，观察靠近抑菌圈边缘的病菌菌丝的生长情况，以远离抑菌圈的病菌菌丝为对照。

1.2.3 拮抗细菌的观察与鉴定

制作YF-6 LB培养液，梯度稀释找到YF-6菌落，并观察其形态。挑取少量YF-6菌株，分置于盛有100、500 μL无菌水的离心管内，振荡均匀，吸取2.5 μL涂于盖玻片上，制作高浓度(100 μL)和低浓度(500 μL)盖玻片样本，在电镜下对YF-6进行观察，并送第三方进行菌种鉴定。

1.2.4 拮抗细菌的生测试验

施用对象为延安1号温室烟苗，设为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四组，每组4株烟苗，保证所选16株烟苗大小接近。YF-6的10倍稀释LB培养液(9×106mL-1)施用于Ⅰ组烟苗；YF-6的50倍稀释LB培养液(1.8×106mL-1)施用于Ⅱ组烟苗；LB 50倍稀释液施用于Ⅲ组烟苗；无菌水施用于Ⅳ组烟苗。

先进行烟苗灌根试验，施用品施用量为每棵烟苗50 mL，灌根后观察烟苗11 d。若灌根对烟苗无害，则重复试验设置，对烟苗进行叶喷试验，3 d后重复叶喷，继续观察烟苗生长情况。若叶喷也对烟苗无害，则将烟草赤星病菌培养液等量喷淋于4组烟苗叶面上，以喷淋后7 d时间为观察截点，评价YF-6的防病效果。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌YF-6

从11份烟草根际土壤样本中分离得到81种形态根际细菌，制作共计243支菌株斜面。初筛得到9株对烟草赤星病菌有拮抗效果的根际细菌。复筛得到1株拮抗效果最好的根际细菌YF-6。

比较对峙试验中赤星病菌的生长参数筛选根际细菌。在表1中，5 d抑菌直径(对峙5 d病菌生长的最大长度减去最小长度)反映拮抗细菌的杀菌能力，12 d边沿远端距离(对峙12 d病菌生长边沿端点之间的直线距离)反映拮抗细菌的占位能力，12 d最小宽度(对峙12 d病菌生长的最小长度)反映病菌活性。光学显微镜下观察(图1、2)，在对峙试验中，细菌YF-6使烟草赤星病菌菌丝颜色加深，膨大变粗，且分支增多。

表1 有效菌株与参照菌株的复筛试验数据

图1 YF-6细菌培养5 d(左)和12 d(右)复筛样本

图2 12 d样本中对峙最近处(左)和对峙最远处(右)的烟草赤星病菌菌丝形态

2.2 YF-6的抑菌谱

图3显示，YF-6对辣椒疫霉病菌、苹果炭疽病菌、棉花枯萎病菌、玉米大斑病菌均有良好的抑菌效果，YF-6具有抑菌广谱性。

图3 YF-6的抑菌谱

2.3 YF-6的形态

图4显示，YF-6菌落外围呈淡黄色，边沿处呈放射锯齿状生长，菌落中心呈奶白色，有两圈轮纹凸起，大轮纹外密集分布细小白色颗粒，挑起时有黏稠感。电镜下，YF-6单菌长1.3～1.5 μm，宽0.5～0.6 μm，呈近似杆状的椭圆形，菌体一端较明亮，偶有尖锐突出，两侧有褶皱，中部有纵向隆起。经青岛正信检测分析有限公司鉴定，YF-6为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。

图4 YF-6菌落和电镜照片

2.4 生测试验

图5显示，Ⅰ、Ⅱ组的温室烟苗叶片深绿，有生长，未见烟草赤星病菌侵染；Ⅲ组和无菌水的温室烟苗出现烟草赤星病菌侵染。

图5 YF-6不同培养液的侵染情况

Ⅰ组的促生效果体现在以下3个指标。Ⅰ组株高平均为14.2 mm，Ⅳ组平均为13.8 mm，Ⅰ组大于Ⅳ组3.1%；Ⅰ组最大叶长平均为14.2 mm，Ⅳ组平均为12.8 mm，Ⅰ组高于Ⅳ组10.6%；Ⅰ组最大叶展宽度平均为23.6 mm，Ⅳ组平均为20.7 mm，Ⅰ组大于Ⅳ组14.1%(表2)。

表2 YF-6 10倍稀释培养液对延安1号温室烟苗促生效果数据

3 小结与讨论

本研究从采自四川、陕西的烟草根际土壤样本中分离得到81种形态、243株根际细菌，对峙筛选出1株拮抗烟草赤星病菌效果最好的细菌YF-6，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。生测试验表明，YF-6 10倍稀释培养液(9×106mL-1)可以防止烟草赤星病菌侵染，且对延安1号温室烟苗有促进生长的作用。

烟草赤星病是一类严重影响烟草生产的病害，烟草赤星病的防治可以分为农业防治、抗性品种选择、化学药剂防治、生物防治[14]。依靠拮抗细菌防治烟草赤星病是烟草植保研究的一个方向[15]，芽孢杆菌因具有产芽孢、抗逆性强、容易在环境中存活与增殖的特点，现已成为研发烟草赤星病生防菌剂的对象[16]。试验证明，本研究得到的烟草根际细菌解淀粉芽孢杆菌YF-6拮抗烟草赤星病菌，且具有研发成为预防烟草赤星病可喷雾水剂的潜力。