2016—2020 年内蒙古某教学医院尿液标本分离菌的耐药性分析及部分大肠埃希菌多位点序列分型

宿瑞俊， 郑文琪， 申慧敏， 吕莹莹， 郭素芳

作者单位： 内蒙古医科大学附属医院检验科，呼和浩特 010050。

尿路感染是最常见的感染性疾病之一。据统计将近50%的女性一年至少经历1 次尿路感染，高达90%的社区获得性和50%的医院尿路感染由大肠埃希菌引起，而且耐药大肠埃希菌快速增长已成为全球共同关注的问题[1]。为了解临床尿路感染细菌的构成及其耐药情况，现将2016—2020 年5 年间内蒙古医科大学附属医院尿液标本分离菌的分布及耐药性监测数据进行分析和总结，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 菌株来自于2016 年1 月—2020年12 月本院门诊和住院患者清洁中段尿液标本。细菌培养计数革兰阴性菌 ≥105CFU/mL，革兰阳性菌≥104CFU/mL。剔除同一患者重复分离的菌株。1.1.2 试 验 器 材 VITEK-2 GP/AST-GP67 和VITEK-2 GN/AST-GN16 鉴定药敏试验卡（Bio-Mérieux 公司产品）、MH 琼脂（天津金章公司）、抗菌药物纸片均为英国OXOID 公司产品。质控菌株为大肠埃希菌 ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、粪肠球菌ATCC 29212。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离鉴定及药敏试验 采用VITEK-2 自动化仪器进行菌株的鉴定，纸片扩散法或VITEK-2 自动化仪器法进行药敏试验。用万古霉素E 试验条测定MIC 值复核确认万古霉素不敏感菌株。VITEK-2 自动化仪器法检测超广谱β内酰胺酶（ESBL）菌株。

1.2.2 数据分析 采用WHONET 5.6 软件统计分析。按CLSI 2020 年版标准判读药敏结果。头孢唑林折点参考非复杂泌尿道感染敏感折点MIC≤16 mg/L、耐药折点≥32 mg/L。

1.2.3 系统发育分型及B2 型菌株MLST 收集2020 年连续分离204 株大肠埃希菌进行系统发育分型。煮沸法提取204 株大肠埃希菌DNA，参照文献 [2]进行多重 PCR 扩增ChuA、YjaA、TspE4.C2. 基 因，将204 株 大 肠 埃 希 菌 分 为A、B1、B2 或D 四 型。对71 株B2 型 大 肠 埃 希 菌 根 据Achtman 方案，扩增7 个管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA 和recA），扩增产物送中美泰和生物技术（北京）有限公司测序。将序列提交MLST 数据库 （http：//pubmlst.org/organisms/escherichia-spp）进行比对，获得每个管家基因的等位基因号，从而得到每株菌的ST 型别。

2 结果

2.1 菌株来源及分布

共收集来自尿液非重复分离菌9 008 株。78.6%菌株来自住院患者，21.4% 菌株来自门诊患者。革兰阴性菌80.1%，革兰阳性菌19.9%。排名前5 位的细菌分别是大肠埃希菌58.7%、屎肠球菌8.8%、肺炎克雷伯菌6.7%、粪肠球菌5.1%、无乳链球菌4.0%。变形杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌也有一定的占比，金黄色葡萄球菌占1.2%，见表1。

表1 主要菌种菌株数分布构成比Table 1 Distribution of bacterial strains isolated from urine from 2016 to 2020

2.2 革兰阳性菌药敏试验结果

粪肠球菌对测试抗菌药物的耐药率均显著低于屎肠球菌。无乳链球菌和屎肠球菌对喹诺酮类抗菌药物耐药率＞87%，粪肠球菌耐药率接近50%。粪肠球菌和屎肠球菌对氨苄西林的耐药率分别为0 和95.5%；未发现利奈唑胺耐药的粪肠球菌和屎肠球菌，未发现万古霉素耐药的粪肠球菌，发现万古霉素耐药的屎肠球菌3 株，均用万古霉素E 试验条测定MIC 值进行确认。甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA） 对β 内酰胺类、 大环内酯类、 氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物的耐药率均显著高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），对甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率MRSA 低于MSSA，未发现对万古霉素和利奈唑胺耐药的金黄色葡萄球菌。见表2。

表2 革兰阳性菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 2 Susceptibility of Gram-positive bacteria to antimicrobial agents（%）

2.3 革兰阴性菌药敏试验结果

2.3.1 肠杆菌科细菌 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBL 阳性检出率分别为44.1%和36.0%。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类仍高度敏感，但均出现耐药菌株，对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别为0.4%、0.3%和5.5%、4.9%。大肠埃希菌5 年间对测试抗菌药物耐药情况变化不大，只有碳青霉烯类、喹诺酮类抗菌药物的耐药率呈现上升趋势。见表3 和表4。

表3 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 3 Susceptibility of E. coli and K. pneumoniae to antimicrobial agents（%）

表4 2016—2020 年大肠埃希菌对抗菌药物的敏感率和耐药率Table 4 Susceptibility of E. coli to antimicrobial agents by year from 2016 to 2020（%）

2.3.2 不发酵糖革兰阴性菌 铜绿假胞菌对所有测试抗菌药物的耐药率均显著低于鲍曼不动杆菌。鲍曼不动杆菌对阿米卡星耐药率略低于20%，对替加环素耐药率较低为3.2%，对其他测试抗菌药物的耐药率均在30%以上；铜绿假单胞菌对所测试的抗菌药物的耐药率低于25%，见表5。

表5 铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 5 Susceptibility of P. aeruginosa and A. baumannii to antimicrobial agents（%）

2.4 菌株种系分型和MLST

对2020 年尿液标本分离的204 株大肠埃希菌株的种系分型，A 型15.7% （32 株）、B1 型6.4%（13 株）、B2 型47.0% （96 株）、D 型24.0% （49株）、另有6.9% （14 株）不能进行分型。71 株B2 型大肠埃希菌的MLST 共检出6 种ST 型别（ST1193、ST131、ST95、ST4、ST12、ST3910），其中 ST1193 数量最多， 占54.9%（39 株），其次是ST131（25 株），占35.2%，ST95 型4 株，ST4 型、ST12 型和ST3910 型各1 株。6 种序列类型的分布及耐药性总体情况见表6。

表6 大肠埃希菌6 种序列类型的分布及耐药性总体情况Table 6 Patient demographics and antimicrobial resistance rate summarized by 6 sequence types of E. coli

3 讨论

我院5 年间尿液标本的临床分离菌以革兰阴性菌为主，前5 位的细菌为大肠埃希菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和无乳链球菌，其中前4位的菌种与CHINET 监测网2020 年泌尿道标本分离前4 位的菌种一致[3]。

肠球菌是尿路感染中仅次于大肠埃希菌的第二大病原菌。本组资料尿液标本的屎肠球菌检出率高于粪肠球菌，与CHINET 监测网[3]、余建洪等[4]报道一致。国内也有尿路感染粪肠球菌检出率高于屎肠球菌的报道[5-7]。屎肠球菌对多数抗菌药物的耐药率明显高于粪肠球菌。粪肠球菌对青霉素、氨苄西林的耐药率较低, 分别是3.1%和0；而屎肠球菌对二者的耐药率则很高，分别是93.3%和95.5%。肠球菌对利奈唑胺和万古霉素仍高度敏感，未检出对利奈唑胺耐药的肠球菌属细菌，亦未检出对万古霉素耐药的粪肠球菌，检出0.4%的万古霉素耐药屎肠球菌。肠球菌感染治疗，一般采用β 内酰胺类联合氨基糖苷类，但对于青霉素、氨苄西林或高浓度庆大霉素耐药菌株则无协同作用。

大肠埃希菌是引起尿路感染最主要的病原菌，75%单纯性尿路感染和65%复杂性尿路感染是由大肠埃希菌所致[8]。本组资料显示尿液标本分离菌居首位的大肠埃希菌占到58.7%。大肠埃希菌对左氧氟沙星的耐药率高达70% 以上，碳青霉烯类抗生素仍然对大肠埃希菌保持较高抗菌活性。5 年间大肠埃希菌对测试抗菌药物的耐药性变化不大，包括对喹诺酮类抗菌药物的高耐药率，可能是喹诺酮类被临床医师广泛用于治疗尿路感染。

上世纪90 年代中期，大肠埃希菌ST131 出现，在世界范围内广泛传播，并导致大肠埃希菌的耐药率迅速增高[9]，其中ESBL 阳性率较高，有研究报道中国某地区ST131 菌株中ESBL 阳性率为65.5%[10]，本研究也达到了56.0%。有研究发现，大肠埃希菌 ST131 克隆株与肾盂肾炎高度相关，尤其是ST131 的H30 亚克隆株与持续性或复发性尿路感染密切相关[11-13]。自2012 年以来，一种新的氟喹诺酮类耐药大肠埃希菌ST1193 在多个国家出现，在美国氟喹诺酮类耐药的大肠埃希菌ST1193 在尿路感染中的比例急剧增长[9,14-17]，在中国，大肠埃希菌ST1193 相关研究也有报道[18-19]，本组资料中大肠埃希菌ST1193 也有较高的分离率，占54.9%。ST131 和ST1193 两种型别菌株对β 内酰胺类抗生素的不敏感率前者高于后者，但对非β 内酰胺类抗生素的不敏感率两者大致相仿，均很高：对左氧氟沙星和环丙沙星等氟喹诺酮类的不敏感率均高达87.2%以上；对甲氧苄啶-磺胺甲唑的不敏感率两者约50%左右。ST131 对庆大霉素的不敏感率（48.0%）高于ST1193（25.6%）。提示不同型别的大肠埃希菌对抗菌药物的耐药率具有各自的特点，如能在可行的情况下开展大肠埃希菌的MLST，有助于尿路感染的甄别诊断和治疗。

细菌对抗菌药物耐药率的增高和多重耐药菌株的出现成为医学发展中重要的问题[20]。尿路感染早期及时诊断及治疗可避免对肾脏造成损害[21-22]。尿液标本临床分离菌的培养和药敏试验对尿路感染的诊断和治疗具有十分重要的指导意义。对疑有尿路感染症状的患者应及时送检尿标本做病原学检查，根据药敏结果合理使用抗菌药物，减少耐药菌株的产生。