919糖浆对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能保护效应及其机制研究

潘丹青，徐月妹

(1.上海中医药大学，上海 201203；2.复旦大学附属金山医院中医内科，上海 201508)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFLD) 指除酒精和其他明确损肝因素外所致的以肝细胞脂肪沉积过度及脂肪变性为主要特征的临床综合征[1]。近年来，随着人们饮食结构和生活方式的变化，非酒精性脂肪肝的发病率持续递增，且患病人群逐渐年轻化，已成为人类最常见的慢性肝脏疾病之一[2]。常规西药干预为NAFLD的主要治疗方法，可改善患者肝功能、血脂水平等，但长时间应用易诱发诸多副作用或不良反应，具有一定的局限性。中医认为非酒精性脂肪肝属于“痰浊”“肝癖”“胁痛”“血瘀”范畴，所以中医治疗非酒精性脂肪肝患者一般主张化痰、祛湿、活血、疏肝[3]。919糖浆是一个中药复方制剂，由猕猴桃、太子参、茯苓、白术、陈皮、白豆蔻、淫羊藿、丹参、柴胡等药组成，集调理阴阳、理气活血、健脾化湿、清热解毒、滋养肝肾等法于一炉。既往研究[4-5]证实该方安全有效，具有保肝降酶、抗肝纤维化的作用。本研究拟通过复制NAFLD动物模型，观察919糖浆对NAFLD大鼠的肝功能及其肝组织形态的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠，SPF级，雄性，体重(170±10) g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证编号：SYXK(沪)2015-0008。动物饲养于上海市公共卫生临床中心实验动物部。室温20～26 ℃、相对湿度40%～70%，12 h避光，12 h光照，自由饮食。所有实验大鼠的使用和喂养严格遵照动物保护协会所规定的有关条款。

1.2 动物饲料及实验药品

高脂饲料配方：88%普通饲料，2%胆固醇，10%猪油。由北京博爱港生物技术有限公司生产，货号：BAG1001。

919糖浆委托山东广育堂国药有限公司生产，产品代号TJ004,生产批号：20181201。

组成：猕猴桃汁20 g，太子参5 g，丹参10 g，柴胡2 g，白术5 g，陈皮2.5 g，淫羊藿4g，白豆蔻1.5 g。制法：蒸馏水45 mL煮沸，加蔗糖溶解，加热至100 ℃，趁热保温过滤，自滤器加热蒸馏水100 mL即得。

1.3 主要仪器与试剂

DNM-9602酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)，A-1506P紫外分光光度计(上海谱元仪器有限公司)，正置显微镜(日本NIKON公司)，移液器(美国吉尔森P型移液器公司)，恒温烘箱(上海恒一科学仪器有限公司)，冰冻切片机(湖北徕克公司)，摊片机(湖北徕克公司)，水浴锅[Leica(莱卡公司)]，显微图象分析系统(日本NIKON公司)，成像系统(Tanon公司)，甲醛(10010018)、异丙醇(40064360)购自上海国药集团，油红O(S19039，上海源叶生物科技有限公司)，甘油明胶(IH0270，北京雷根生物技术有限公司)，甘油三酯试剂盒(A110-2)，总胆固醇试剂盒(A111-1)，谷草转氨酶试剂盒(C0010-2)，谷丙转氨酶试剂盒(C009-2)，微量丙二醛试剂盒(A003-2)，超氧化物歧化酶试剂盒(A001-1)均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 方法

1.4.1 实验动物分组与给药 造模及分组：随机选取9只雄性SD大鼠作为正常组，予以普通饲料喂养；25只雄性SD大鼠作为造模组，予以高脂饲料喂养，连续喂养14周，复制NAFLD模型。在14周末，分别从正常组和造模组随机选取1只大鼠处死，对肝脏组织进行油红O染色。光镜下见到超过5%的脂肪变性的肝细胞即表明造模成功[6-7]。造模成功后使用SPSS22.0软件，随机将造模组大鼠分为模型组、高剂量组、低剂量组。正常组大鼠体重为(521.22±12.58) g；模型组大鼠体重为(522.56±13.86) g；919糖浆高剂量组大鼠体重为(523.37±14.33) g；919糖浆低剂量组大鼠体重为(525.45±13.48) g。各组大鼠体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

药物干预方法：正常组大鼠不进行药物干预，模型组大鼠给予生理盐水10 mL· kg-1· d-1进行灌胃给药；高剂量组大鼠给予919糖浆27 g· kg-1·d-1进行灌胃给药；低剂量组大鼠给予919糖浆6.75 g·kg-1·d-1进行灌胃给药[4]。各组均干预8周。

1.4.2 样本采集 干预8周后，各组通过相同的步骤采集各组大鼠的血液及肝脏标本：先将各组大鼠禁食12 h，在处死前称重大鼠，用10%的水合氯醛进行麻醉，打开腹腔，经下腔静脉采血，离心后取上清液。随后快速地将肝脏分离出来，并用生理盐水予以冲洗，再用滤纸去除上面的水分，最后给肝脏进行称量，得到的数字就是肝湿重，肝湿重占动物体重的百分比即为肝指数。从肝脏右侧最大叶取2×2 cm2大小的组织保存到-80 °C冰箱，待测MDA、SOD；再取2×2 cm2大小的肝脏组织，将组织置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，待HE染色用。

1.4.3 指标检测 肝功能、脂代谢及氧化应激指标：取出血清后，严格按照试剂盒说明书操作，采用酶联免疫吸附法测定血清中TG、TC、ALT、AST、SOD、MDA含量。

HE病理学检测：取大鼠肝脏组织，采用10%福尔马林固定，石蜡包埋后切片，二甲苯、乙醇依次脱蜡和水化。将入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色5 min，并在盐酸及氨水中分色。流水冲洗1 h后置入蒸馏水中，将切片置于伊红染色液染色2 min。切片蒸馏水洗涤后，经无水乙醇脱水，二甲苯透明后进行封片，中性树脂固定后显微镜下观察组织病理变化。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠体重、肝湿重、肝指数比较

与正常组比较，模型组大鼠肝湿重与肝指数上升(P<0.05)；与模型组比较，高剂量组和低剂量组肝湿重与肝指数降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量及肝湿重、肝指数指标

2.2 各组大鼠肝功能及脂代谢指标比较

与正常组比较，模型组TG、TC、ALT、AST含量增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，低剂量组与高剂量组TG、TC、ALT及AST含量均下降，差异有统计学意义(P<0.01)。高、低剂量组相比，TG、TC、ALT及AST含量差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 干预后各组大鼠肝功能及脂代谢指标比较

2.3 各组大鼠肝组织MDA和SOD比较

与正常组比较，模型组大鼠肝组织中MDA增加，SOD降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，低剂量组与高剂量组MDA值降低，SOD增加，差异有统计学意义(P<0.05)，高、低剂量组组间比较，MDA，SOD差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 干预后各组大鼠肝组织MDA、SOD比较

2.4 干预后各组大鼠形态学比较

干预8周后,各组大鼠肝脏HE染色显示(200×)：正常组的大鼠的肝小叶结构表现正常，肝细胞大小形态正常、结构清楚完整，核圆清晰可见，少量肝细胞内可见细微空泡，肝窦显示清晰，未见明显炎细胞浸润。与正常组相比，模型组肝细胞结构紊乱，肝小叶的结构比较模糊，肝细胞明显肿胀，肝细胞内呈现大量大小各异的空泡沉积，肝窦消失，局灶可见少量炎细胞浸润。与模型组相比，高剂量组与低剂量组肝细胞肿胀减轻，肝细胞内空泡数量减少、空泡形状缩小，高剂量组较低剂量组改善更为明显。见图1。

3 讨论

NAFLD是一种与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压、高脂血症和代谢综合征相关的肝病，给患者、其家人和社会带来严重的健康、经济和体验负担[8]，由于糖尿病和肥胖症的流行，NAFLD 的患病率在中国迅速增加[9-10]。中医药在治疗非酒精性脂肪肝各个方面均有着突出的优势，追溯古代文献中对非酒精性脂肪肝的临床特点、病因病机等描述，将其归纳为肥气、痰浊、胁痛、积聚、肝癖等范畴[11]。病因以湿盛为主，病机以脾虚为首，总的来说，非酒精性脂肪肝多因饮食不节、起居失常、情志不调、久病体虚，引起肝失疏泄、脾失健运、痰湿内阻、气机不利、瘀血阻滞等导致肝脾肾三脏功能失调而致[12]。919糖浆是一种中药复方制剂，由猕猴桃、太子参、茯苓、白术、陈皮、白蔻、淫羊藿、丹参、柴胡组成。具有燮理阴阳、理气活血、健脾化湿、清热解毒、滋养肝肾等功效。在临床可以用于肝损伤的肝细胞保护。

本研究利用高脂饮食成功复制大鼠非酒精性脂肪肝模型，模型组大鼠与正常大鼠比较，肝功能及脂代谢指标出现异常，光镜下肝组织形态出现大量大小各异的空泡沉积，肝窦消失，局部炎细胞浸润，呈现脂肪肝及肝损伤的特点。通过给予919糖浆灌胃干预，研究结果表明，无论剂量高低，用药组大鼠肝功能指标ALT、AST及脂代谢相关指标TG、TC与模型组比较，含量水平降低，光镜下肝组织形态分析也显示：药物组比模型组，肝细胞肿胀减轻，肝细胞内空泡数量减少、空泡形状缩小，结果提示，919糖浆可以有效改善NAFLD大鼠肝功能，纠正大鼠脂代谢异常状态，对肝损伤形成保护效应，且该效应呈现剂量依赖特点，即高剂量组效应比低剂量效应更优。进一步通过检测氧化应激的相关指标SOD、MDA，结果发现，模型组大鼠SOD活性明显降低，MDA含量明显增多，提示NAFLD与氧化应激相关，药物干预后，大鼠肝组织SOD含量升高，MDA含量降低，提示药物效应与改善大鼠氧化应激水平有关。本研究是对于919糖浆治疗性给药对脂肪肝大鼠保护作用的初步探讨，与同类研究[13-16]相比较，我们将目光聚焦于氧化应激和增强抗氧化防御治疗NAFLD的机制。但对于其更深层次的分子机制尚未充分揭示，这也将是今后研究的一个重要方向。

综上，919糖浆可通过减少NAFLD大鼠肝组织中的活性氧含量，增强抗氧化防御水平，减少氧化应激损伤来实现对于NAFLD大鼠肝组织的保护效应，且该效应成剂量依赖的特点。