白细胞介素-2和信号转导和转录激活因子5在宫颈病变患者血清、宫颈组织和细胞中的表达及意义

杜 靖,李 晨,王晓静，李婉悦，樊 凯,沙 静

(1.新疆医科大学基础医学院生理学教研室/新疆地方病分子生物学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；3.新疆生产建设兵团医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

宫颈癌是全球女性癌症相关死亡的第四大原因[1]。近年来，中国城乡妇女宫颈癌病死率呈上升趋势[2]，其中宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)约占临床宫颈癌类型的80%[3]，与人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染密切相关[4]。有研究报道，白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)与白细胞介素-2受体(interleukin-2 receptor，IL-2R)水平与宫颈病变分化程度显著相关[5]。信号转导和转录激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)激活可增强宫颈癌细胞的迁移和侵袭[6]。IL-2和酪氨酸激酶(Janus kinase，JAK)/STAT通路在多种HPV相关癌症中的具有重要作用，但关于其在HPV相关癌症辅助诊断及预后评估中的作用的研究报道较少。基于此，本研究比较CSCC、慢性宫颈炎和正常女性血清、宫颈组织蜡块及宫颈脱落细胞中IL-2、IL-2R和STAT5表达变化，探讨IL-2、STAT5在宫颈病变进展中的预测价值，以期为宫颈病变的诊断和预防提供一种新的检测指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2020年6月至2021年6月新疆生产建设兵团医院门诊或住院的25例CSCC患者(CSCC组)、40例慢性宫颈炎患者(慢性宫颈炎组)为研究对象。病例纳入标准：(1)有性生活史；(2)CSCC患者在行妇科检查发现异常或疑似癌症，如宫颈柱状上皮外移、宫颈息肉、赘生物、菜花样及结节样肿物，宫颈管增粗或桶状宫颈；宫颈癌筛查试验阳性，宫颈细胞学异常，用子宫颈细胞学描述性诊断报告≥非典型鳞状细胞，并经宫颈液基细胞学、组织病理学诊断确诊；(3)慢性宫颈炎患者行妇科检查时肉眼观察宫颈有红、糜烂样改变，宫颈肥大、白带增多呈黏液态或脓态，经宫颈液基细胞学、组织病理学诊断确诊；(4)患者和(或)家属知情同意并签署知情同意书。病例排除标准：(1)具有免疫缺陷以及其他免疫疾病者；(2)合并高血压、糖尿病或其他恶性肿瘤；(3)近期内曾接受过放化疗、干扰素、免疫抑制治疗的患者；(4)哺乳期受试者。另外，选择体检健康的有性生活史的50例女性为健康对照组。CSCC组患者年龄35～61(45.48±9.48)岁；慢性宫颈炎组患者年龄28～59(42.30±6.43)岁；健康对照组受试者年龄25～69(46.88±9.13)岁；3组受试者年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。另收集新疆医科大学第一附属医院和新疆生产建设兵团医院病理科石蜡包埋的宫颈炎组织35例和CSCC组织87例(高分化30例，中分化42例，低分化15例)，所有宫颈组织均经宫颈液基细胞学、组织病理学诊断确诊为宫颈炎或者CSCC。

1.2 主要试剂和仪器兔抗人多克隆抗体STAT5、磷酸化STAT5(phosphorylated STAT5,p-STAT5)、IL-2购自武汉博士德生物工程有限公司，IL-2R一抗、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥公司生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，QIAamp RNA Blood Mini Kit试剂盒购自德国Qiagen公司，酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)IL-2检测试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司；Thin Prep细胞保存液购自北京力普生物技术研究院，RNA引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成，互补脱氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA)检测试剂盒购自日本TaKaRa公司，HPV分型检测试剂盒购自豪洛捷医疗科技(北京)有限公司；Klab MRX A2000酶标仪购自上海申蒙检测技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 宫颈脱落细胞采集及HPV检测3组受试者样本采集前24 h内禁止性生活、阴道检查及阴道内用药，于非月经期，在窥阴器下暴露宫颈口，无菌棉球擦拭干净，将取样刷置于宫颈口，按顺时针方向旋转5圈，取出取样刷放入保存液中备用；另外，应用HPV取样器插入宫颈内口位置，旋转3圈，停留约10 s取出，置于Thin Prep细胞保存液中保存。

1.3.2 血清采集抽取3组受试者晨起空腹静脉血5 mL，置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)管中，4 ℃ 3 000 r·min-1离心5 min，分离血清，置于-20 ℃冰箱储存。

1.3.3 荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测宫颈脱落细胞中HPV-DNA将Thin Prep细胞保存液于4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min，取沉淀细胞液，加入细胞裂解液，置冰袋上反复吹打；室温静置10 min，将裂解液收集到1.5 mL EP管中。加入200 μL氯仿，手动上下颠倒摇晃15 s，室温静置3 min，4 ℃ 10 000 r·min-1离心15 min，将上层水相转移到新的EP管中，加入 500 μL 异丙醇，室温静置 10 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，弃上清；加1 mL 体积分数75%无酶乙醇，上下颠倒洗涤，4 ℃、7 500 r·min-1离心 5 min，弃上清，静置干燥，挥发残留乙醇，加30 μL DEPC水充分溶解RNA，置于-80 ℃冰箱保存，避免反复冻融。采用荧光定量PCR检测HPV-DNA，反应体系及扩增条件参照试剂盒说明书；应用Klab MRX A2000酶标仪显色，根据说明书观察薄膜上显像，紫蓝色圆点为阳性。

1.3.4 ELISA法检测宫颈脱落细胞和血清中IL-2水平取宫颈脱落细胞悬液，4 ℃、10 000 r·min-1离心1 min，取上清液待测；另取血清待测。按IL-2 ELISA检测试剂盒说明书配置标准品，将待测样品和标准品滴加至16孔酶标板中，覆膜封板，37 ℃孵育90 min，甩干；然后，每孔加生物素化抗体工作液100 μL，酶标板覆膜封板，37 ℃孵育60 min，弃去液体，洗板3次；每孔加酶结合物工作液100 μL，37 ℃孵育30 min，洗板5次，每孔加显色剂90 μL，37 ℃避光孵育15 min，加终止液50 μL终止反应，应用Klab MRX A2000酶标仪在450 nm波长处测量各孔的光密度值，绘制标准曲线，计算IL-2表达量。

1.3.5 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)检测3组受试者宫颈脱落细胞中IL-2、IL-2R、STAT5a和STAT5b mRNA表达取宫颈脱落细胞悬液5 mL，应用柱吸附方法抽提RNA，利用Naodrop 2000 核酸定量仪测定RNA浓度，应用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。然后，应用qRT-PCR法检测IL-2、IL-2R、STAT5a和STAT5b mRNA。反应体系(20 μL)：SYBR Premix Ex Taq II(2×)10.0 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)0.8 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.8 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，DNA模板1.0 μL，用RNase Free ddH2O补足20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s； 95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共循环40次；反应融解曲线：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。每个样本做2个复孔，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参。从美国国家生物技术信息中心数据库下载IL-2、IL-2R、STAT5a、STAT5b和GAPDH mRNA序列，设计qRT-PCR引物，具体引物序列：IL-2上游引物序列为5′-CTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCACAATG-3′，下游引物序列为5′-GTGAGCATCCTGGTGAGTTTGGGATTCTTG-3′，长度为208 bp；STAT5a上游引物序列为5′-TGTTCAGGATCTCACCACTGCACTCGTTG-3′，下游引物序列为5′-TCAACGCCACCATCACGGACATTATCTCAG-3′，长度为248 bp；STAT5b上游引物序列为5′-ACGTGAAGCCACAGATCAAGCAAGTGGTC-3′，下游引物序列为5′-CTACGTCCATTGTGTCCTCCAGATCGAAG-3′，长度为200 bp；IL-2R上游引物序列为5′-GACTGCTCACGTTCATCATGGTGCCTG-3′，下游引物序列为5′-GTTGTCCCAGGACGAGTGGCTAGAG-3′，长度为209 bp；GAPDH上游引物序列为5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物序列为5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，长度为150 bp。利用ABI Q2 Real-Time PCR仪及软件进行分析，采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量，△Ct=目标基因Ct-内参Ct值(Ct值代表每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所需循环数)。

1.3.6 免疫组织化学染色法检测宫颈炎和CSCC组织中STAT5、p-STAT5、IL-2和IL-2R蛋白表达

将宫颈炎和CSCC石蜡组织切片(片厚4.0 μm)，常规脱蜡水化，然后在0.01 mmol·L-1柠檬酸抗原修复液中应用微波修复法预处理，应用体积分数 0.3% H2O2孵育10 min阻断内源性过氧化物酶活性；然后，滴加试剂体积分数10%山羊血清于组织切片上，室温孵育10 min，加入STAT5一抗(滴度1100)、p-STAT5一抗(滴度1200)、IL-2一抗(滴度1200)和IL-2R一抗(滴度125)，阴性对照为等量PBS替代一抗，4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗5 min，共3次。滴加试剂B室温孵育10 min，PBS冲洗5 min，共3次；滴加试剂C室温孵育10 min，PBS冲洗5 min，共3次。滴加新鲜配制的DAB显色液，室温显色2～5 min，苏木精复染，脱水，二甲苯透明、封片，光学显微镜下观察。结果判定：以宫颈上皮细胞胞质或细胞核染成棕黄色为阳性判定标准。按阳性细胞在组织中所占面积分为5个等级：<5%为阴性(-)，5%～25%为弱阳性(+)，>25%～50%为阳性(++)，>50%～75%为中等度阳性(+++)，>75%为强阳性(++++)，将+、++、+++、++++计为阳性表达。

2 结果

2.1 3组受试者HPV感染情况比较健康对照组受试者HPV16/18阳性7例(14.0%)，HPV16/18阴性43例(86.0%)；慢性宫颈炎组患者HPV16/18阳性13例(32.5%)，HPV16/18阴性27例(67.5%)；CSCC组患者HPV16/18阳性17例(68.0%)，HPV16/18阴性8例(32.0%)。3组受试者HPV16/18阳性率比较差异有统计学意义(F=12.640，P> 0.05)；慢性宫颈炎组和CSCC组患者HPV16/18阳性率高于健康对照组，差异有统计学意义(χ2=6.762、13.868，P<0.05)；CSCC组患者HPV16/18阳性率显著高于慢性宫颈炎组，差异有统计学意义(χ2=7.870，P<0.05)。

2.2 3组受试者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平比较结果见表1。慢性宫颈炎组和CSCC组HPV16/18阳性患者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平低于健康对照组，CSCC组HPV16/18阳性患者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平低于慢性宫颈炎组，差异有统计学意义(P<0.05)；慢性宫颈炎组和CSCC组HPV16/18阴性患者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平低于健康对照组，CSCC组HPV16/18阴性患者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平低于慢性宫颈炎组，差异有统计学意义(P<0.05)；3组HPV16/18阳性受试者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平低于HPV16/18阴性受试者，差异有统计学意义(P<0.05)。HPV16/18阳性受试者宫颈脱落细胞与血清中IL-2水平呈正相关(r=0.665，P<0.05)。

表1 3组受试者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平比较

2.3 3组受试者宫颈脱落细胞中IL-2、IL-2R、STAT5a和STAT5b mRNA相对表达量比较结果见表2。慢性宫颈炎组和CSCC组患者宫颈脱落细胞中IL-2、IL-2R、STAT5a和STAT5b mRNA相对表达量低于健康对照组，CSCC组患者宫颈脱落细胞中IL-2、IL-2R、STAT5a和STAT5b mRNA相对表达量低于慢性宫颈炎组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 3组受试者宫颈脱落细胞中IL-2、IL-2R、STAT5a和STAT5b mRNA相对表达量比较

2.4 慢性宫颈炎和CSCC宫颈组织中IL-2、IL-2R、STAT5和p-STAT5阳性表达情况比较结果见图1和表3。IL-2和IL-2R蛋白主要在细胞质内表达，偶见细胞核着色；STAT5和p-STAT5蛋白主要在细胞核内表达。CSCC宫颈组织中IL-2、IL-2R阳性表达率显著低于慢性宫颈炎组织，STAT5和p-STAT5阳性表达率显著高于慢性宫颈炎组织，差异有统计学意义(P<0.05)。高分化型CSCC宫颈组织中IL-2、IL-2R阳性表达率显著高于中分化型和低分化型，STAT5和p-STAT5阳性表达率显著低于中分化型和低分化型，差异有统计学意义(P<0.05)；中分化型CSCC宫颈组织中IL-2、IL-2R阳性表达率显著高于低分化型，STAT5和p-STAT5阳性表达率低于低分化型，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 慢性宫颈炎和CSCC宫颈组织中IL-2、IL-2R、STAT5和p-STAT5蛋白阳性表达率比较

3 讨论

CSCC的发生发展是多因素、长期慢性的过程，从HPV感染到宫颈癌可持续15～30 a[7]；在高危型HPV持续感染、低级别宫颈鳞状上皮内病变到CSCC发展过程中，机体的免疫功能与CSCC的发生、发展密切相关[8]。目前，宫颈癌初筛主要是宫颈脱落细胞HPV-DNA检测联合液基薄层细胞法，而宫颈癌诊断的金标准为宫颈组织病理学诊断，虽然已知的生物学检测指标有鳞状上皮细胞癌抗原HPVE6/E7、多肿瘤抑制基因1与Ki67蛋白等[9-11]，但受检测方法及肿瘤特异性等因素制约未在临床上广泛应用，因此，仍需要探索特异、便捷、可靠的生物学标志物来进一步改善宫颈癌的筛查、诊断和预后评估[12]。

HPV 是一种球形、双链闭环的小 DNA 病毒，属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒 A 属。目前已发现的 HPV共有 130个亚型，在众多亚型中分为高危型 HPV 和低危型 HPV。目前常见的高危型 HPV 主要分为皮肤高危型和黏膜高危型，其中黏膜高危型 HPV 病毒可导致外阴癌、膀胱癌等；而低危型 HPV 主要包括皮肤低危型和黏膜低危型两大类，皮肤低危型可导致常疣、扁平疣等，黏膜低危型可导致生殖器、口咽部及食管黏膜感染[13]。研究表明，HPV 感染与宫颈病变关系密切，且持续的HPV感染是导致宫颈癌的重要危险因素之一[14]。PAPPA等[15]研究报道，97.7%的宫颈癌患者为HPV阳性，HPV16、18亚型最常见。本研究结果显示，慢性宫颈炎组和CSCC组患者HPV16/18阳性率高于健康对照组；慢性宫颈炎组患者HPV16/18阳性率低于CSCC，这与PAPPA等[15]研究结果一致，进一步证实HPV16/18感染与宫颈病变进程密切相关。

IL-2由T淋巴细胞分泌，IL-2R来自活化的淋巴细胞膜上IL-2R的A链成分。研究报道，Th1细胞可分泌IL-2等细胞因子，而IL-2可诱导单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等的聚集及浸润，加重细胞损伤，导致正常细胞发生异常增殖及癌变[16]；IL-2不仅调控全身机体免疫，还可渗出于生殖道参与阴道微环境的局部免疫调节。研究表明，HPV相关的宫颈病变患者比健康女性发生显著的免疫因子改变，如IL-2浓度随疾病进展而降低，且随着病变进展，Th1细胞向Th2转化，Th1/Th2比值降低，表现为免疫抑制[17]；本研究结果显示，慢性宫颈炎组和CSCC组HPV16/18阳性、阴性患者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平均分别低于健康对照组HPV16/18阳性、阴性受试者，CSCC组HPV16/18阳性、阴性患者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平低于慢性宫颈炎组HPV16/18阳性、阴性患者；3组HPV16/18阳性受试者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平低于HPV16/18阴性受试者，HPV16/18阳性受试者中宫颈脱落细胞与血清中IL-2水平呈正相关；且慢性宫颈炎组和CSCC组患者宫颈脱落细胞IL-2、IL-2R mRNA相对表达量低于健康对照组，CSCC组患者宫颈脱落细胞IL-2、IL-2R mRNA相对表达量低于慢性宫颈炎组；另外，免疫组织化学检测结果显示，CSCC宫颈组织中IL-2、IL-2R阳性表达率显著低于慢性宫颈炎，高分化型CSCC宫颈组织中IL-2、IL-2R阳性表达率显著高于中分化型和低分化型，中分化型CSCC宫颈组织中IL-2、IL-2R阳性表达率显著高于低分化型患者。这一结果说明，血清IL-2水平随HPV16/18阳性率增高而降低，且血清IL-2水平和宫颈脱落细胞中IL-2、IL-2R水平随宫颈病变分化严重程度而下降。ZHENG等[18]研究报道，在HPV病变中，IL-2在CSCC中表达最低，提示肿瘤早期免疫反应较强、炎症反应较弱。另有研究报道，IL-2在HPV引发的宫颈病变组织中的表达随病变程度加重逐渐下降，而IL-2表达降低导致的机体免疫功能抑制使宫颈癌细胞出现免疫逃逸，从而促进宫颈癌的发生、发展[19-21]。因此，宫颈脱落细胞和血清中IL-2水平可作为预测宫颈病变进展新的标志物。

STAT5基因通过激活共济失调毛细血管扩张突变基因损伤反应来调节基因组扩增，其在HPV阳性的CSCC细胞中被激活，参与促进细胞周期进程、细胞转化和抑制细胞凋亡，在CSCC发生、发展过程中发挥重要作用[22-24]。HPV通过先天性和适应性免疫反应逃避监视建立持续感染，其中JAK/STAT途径是调节先天性免疫反应的主要途径[25]。IL-2能通过JAK3磷酸化激活和JAK1磷酸化缺失进一步激活STAT家族蛋白STAT5a、STAT5b，导致STAT蛋白易位至细胞核，使其下游基因表达增加，从而直接或间接调控细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡[26]，其中STAT5a参与调控细胞增殖而STATb可引起机体免疫反应改变[27-28]。有研究发现，p-STAT5在HPV导致的宫颈癌细胞中增加，其不仅促进宫颈癌发生同时也维持癌细胞的过度增殖、转移、侵袭等恶性表型[29]；反之抑制JAK或降低STAT5磷酸化可抑制宫颈癌细胞生长[30]。本研究结果显示，慢性宫颈炎组和CSCC组患者宫颈脱落细胞中STAT5a和STAT5b mRNA相对表达量低于健康对照组，CSCC组患者宫颈脱落细胞中STAT5a和STAT5b mRNA相对表达量低于慢性宫颈炎组；CSCC宫颈组织中STAT5和p-STAT5阳性表达率显著高于慢性宫颈炎，高分化型CSCC宫颈组织STAT5和p-STAT5阳性表达率低于中分化型和低分化型，中分化型CSCC宫颈组织中STAT5和p-STAT5阳性表达率低于低分化型；本研究结果与上述研究报道结果[29-30]相符，进一步证实STAT5a和STAT5b在宫颈组织中的表达随病变分化严重程度增高而升高，IL-2可能通过JAK/STAT通路激活STAT家族蛋白STAT5a、STAT5b参与宫颈癌的发生、发展。

综上所述，HPV16/18阳性者血清和宫颈脱落细胞中IL-2水平显著低于HPV16/18阴性者,且血清IL-2水平及宫颈病变组织和细胞中IL-2和IL-2R表达水平随宫颈病变分化严重程度加重而下降，STAT5a和STAT5b表达随宫颈病变程度加重而升高；IL-2可能通过JAK/STAT通路激活STAT家族蛋白STAT5a、STAT5b参与宫颈癌的发生、发展。因此，通过常规检测宫颈脱落细胞和血清中IL-2水平可预测宫颈病变进展。