林口红松球果害虫幼虫鉴定及发生时序1)

贺睿智 李泽林 吴健桢 解丹 贾妮娅 孙凡

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

近两年来，黑龙江省的红松(Pinuskoraiensis)原始林和人工林中，先后发现了多种球果种实害虫的危害，部分地区受害严重，造成红松种子产量和质量下降，给苗木繁育及松籽产业带来巨大的影响和损失。如林口县通天一林场，近三年来结实人工红松林球果的受害率近100%，致使部分林分种实颗粒无收。

害虫种类鉴定是种群控制工作的基础，幼虫鉴定是制定防治方案和虫害预测预报的关键。与昆虫成虫形态相比，有关幼虫形态特征的研究和记载较少。虽然鳞翅目幼虫的形态分类特征较少，但具有一定的稳定性，是种类鉴别的重要依据[1-2]。DNA条形码是生物分类学领域出现的一项新技术，其本质是利用一段含有生物信息的DNA片段进行物种鉴别。在昆虫分类领域，主要采用线粒体细胞色素C氧化酶亚单元Ⅰ基因(COⅠ)进行DNA标记。COⅠ基因容易利用通用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，同时在近缘种间基因的差异又足够大，所以该基因鉴定可以快速标记物种的分子特征，对依据形态特征的昆虫鉴定有辅助和验证作用[3]。

球果害虫幼虫生活隐蔽，多种害虫混合发生，致使种群鉴定较为困难。关于红松球果幼虫形态研究的文献较少，上世纪80年代白九维[4]进行了为害针叶树的几种卷蛾幼期研究，包含了部分红松球果害虫；2002年，朴美花等[5]描述了3种韩国红松球果害虫的幼虫形态特性。2020年，卢孟等[6-7]采用毛位图展示球果害虫幼虫的形态特征，使幼虫鉴定更为直观和简便。本研究于2020年6—9月份在黑龙江省七台河市林口县持续采集受害球果，收集球果害虫的幼虫，发现不同月份球果内害虫的种类和数量明显不同。本研究利用幼虫形态特征并结合线粒体COⅠ对比进行种类鉴定，对幼虫形态特别是毛位特征进行了更加详细的描述，分析了不同害虫在红松球果内发生时序，旨在为红松球果害虫的种群鉴定和精准防控提供参考。

1 材料与方法

虫源：2020年6月6日、7月10日、8月10日、9月15日，在黑龙江省七台河市林口县通天一林场40～50年红松林内采集2年生受害球果，每次采集受害球果50个左右。球果下树后立即移到实验室内，阴干2～3 d后剥开球果检出所有球果害虫，浸泡在体积分数为85%的酒精中保存。

幼虫形态鉴定与描述：在体视显微镜下观察幼虫外部形态，幼虫头部朝向观察者左侧。首先依据陆近仁等[1]、Capps[8]编写的鳞翅目幼虫检索表鉴定至科，再与已知松属植物球果害虫幼虫形态特征进行比对，确定样本的种类；描述幼虫形态并绘制幼虫毛位图，绘制方法及毛序的命名借鉴文献[2]、[6]。

分子标记鉴定：选用线粒体COⅠ基因作为分子标记，每种幼虫选取10只待测样本。使用天根DNA提取试剂盒(DP304)，并参照试剂盒中提供的方法从样本中提取总DNA。使用通用引物对线粒体COⅠ基因片段进行聚合酶链式反应扩增，上游引物LCO1490，5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，下游引物HCO2198，5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[7]，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。聚合酶链式反应体系含DNA模板1 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、聚合酶链式反应酶系预混液(Premix Taq)25 μL，加无菌水补至50 μL。聚合酶链式反应程序：94 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃总延伸7 min。聚合酶链式反应产物用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测，委托北京睿博兴科生物技术有限公司对扩增产物进行纯化和测序，测序引物同扩增引物，采用正反双向测序。测序结果用DNAstar v7.1软件包中Seq Man程序进行拼接和校正，并去除序列两端引物部分。使用NCBI及BOLD数据库中已有的序列进行相似性比对。

害虫发生时序测定：统计不同采样时间球果幼虫总数及不同种类幼虫的数量，计算不同种类占总虫数的比例。

2 结果与分析

2.1 红松球果害虫幼虫形态及分子标记鉴定

2.1.1 油松球果小卷蛾(Gravitarmatamargarotana)

依据鳞翅目幼虫分科检索表鉴定至卷蛾科(Tortricidae)小卷蛾亚科(Olethreutinae)；并与白九维[4]、卢孟[6]描述的油松球果小卷蛾幼虫的形态特征大体相近。

形态特征：老熟幼虫体长15～17 mm，体表肉红色到红褐色，头部及前胸背板深褐色。毛片不明显，颜色仅略深于体色。由图1可见：第一胸节(T1)，气门盾近方形，着生3根刚毛和1个明显的毛孔，3根刚毛位置不在一条直线上，呈钝角三角形排列。第二胸节(T2)和第三胸节(T3)背毛和亚背毛均2根，着生在圆形毛片上，毛片相接或略有分离。第一腹节(A1)至第七腹节(A7)亚背毛与亚背微毛在一圆形毛片上，与气门不相连。第八腹节(A8)亚背毛与亚背微毛位于同一毛片，位置在气门前侧下方。第九腹节(A9)背板两侧中央有缺口。第十腹节(A10)，臀板前2根刚毛上下纵向排列，后2根刚毛横向排列，位置与前侧2根刚毛中的低位者平齐。

分子标记鉴定：将测序样本测序结果在BOLD数据库中进行比对，与库中G.margarotana的序列相似度为99.84%，验证了形态鉴定的结果。

2.1.2 小卷蛾未知种(Cydiasp.)

依据鳞翅目幼虫检索表鉴定至卷蛾科(Tortricidae)小卷蛾亚科(Olethreutinae)；与卢孟[6]记录的小卷蛾属未知种(Cydiasp.)特征大体相近。

形态特征：老熟幼虫体长7～9 mm，头部及背板土黄色，体表浅米色。头部单眼区与颊后区有棕色暗斑。毛片不明显，颜色仅比体色略深。由图2可见：第一胸节(T1)，气门盾月牙形，有3根刚毛，排列不在一条直线上，中间的刚毛最长。第二胸节(T2)及第三胸节(T3)，背毛和亚背毛均2根，背毛位于一个长形毛片，亚背毛位于一个近葫芦形毛片。第一腹节(A1)至第七腹节(A7)，亚背毛与亚背微毛在一个横向毛片且与气门相连。第八腹节(A8)，亚背毛和亚背微毛在一个近圆形毛片，位置在气门正前方。第十腹节(A10)，臀板前2根刚毛上下纵向排列，后2根刚毛横向排列，位置与前侧2根刚毛中的低位者平齐。

分子标记鉴定：将测序结果在NCBI数据库中进行比对，相似度较高的序列均为小卷蛾属(Cydia)，序列相似度最高为92.57%(Cydiasp.，KT142096.1)，暂定为小卷蛾属。

2.1.3 冷杉梢斑螟(Dioryctriaabietella)

依据鳞翅目幼虫分科检索表鉴定至螟蛾科(Pyralidae)，与朴美花等[5]、卢孟[6]描述的冷杉梢斑螟幼虫形态大体相同。

形态特征：老熟幼虫体长18～26 mm，体色变异较大，可分为深色型和浅色型两种体色，深色型体背棕黑或灰黑色，腹面灰白色，体褶处有断断续续的深褐色刻点；浅色型体背污黄或浅棕色，背中线深棕色，虫体两侧背毛和亚背毛之间各有一条线状斑纹，腹面浅黄微红。幼龄幼虫毛片颜色较深，老龄幼虫气门以下毛片颜色变浅。由图3可见：第一胸节(T1)，气门盾马蹄形，位置在气门的正前方，宽度略大于气门直径，上下排列着生2根刚毛，上侧刚毛较短。第二胸节(T2)，亚背毛2根，较长者着生在圆形浅色毛片上，外面围绕着深色骨化环，较短者着生在骨化环上。第三胸节(T3)，亚背毛2根，着生在一个葫芦形毛片上。第八腹节(A8)，亚背毛片浅色，外环绕一个深色的骨化环。第九腹节(A9)，亚背毛2根，着生在2个圆形毛片上，彼此分离；侧毛群3根，位于一个长形毛片上。第十腹节(A10)，臀板上第二根刚毛位置低于其他3根刚毛。

分子标记鉴定：将测序结果在NCBI数据库中进行比对，与库中D.abietella(KX046464)的序列相似度为100%，验证了形态鉴定的结果。

2.1.4 赤松梢斑螟(D.sylvestrella)

依据鳞翅目幼虫分科检索表鉴定至螟蛾科(Pyralidae)，与朴美花等[5]、卢孟等[6]描述的赤松梢斑螟幼虫形态一致。

形态特征：老熟幼虫体长16～25 mm，头部黑褐色，前胸背板黑色略有光泽，体背灰黑色，腹面灰白色，体表密布黑色刻点，褶皱处居多。各体节毛片均较大且颜色较深。由图4可见：第一胸节(T1)，气门盾较大，位置偏向气门下方，包围气门周长约四分之一，气门盾上下排列着生2根刚毛，下侧刚毛较长。第二胸节(T2)，亚背毛2根，较长者着生在圆形浅色毛片上，外面围绕着深色骨化环，较短者着生在骨化环上。第三胸节(T3)，亚背毛2根，着生在一个椭圆形毛片上。第八腹节(A8)，亚背毛片外环绕一个深色的骨化环。第九腹节(A9)，亚背毛2根，2个毛片相接或略有分离；侧毛群3根，位于一个长形毛片。第十腹节(A10)，臀板上前2根刚毛上下纵向排列，后2根刚毛横向排列，位置与前2根刚毛中的高位者平齐。

分子标记鉴定：将测序结果在NCBI数据库中进行比对，与库中D.sylvestrella的序列相似度为99.54%(DQ247746.1)，验证了形态鉴定的结果。

2.1.5 小花尺蛾(Eupitheciaabietariadebrunneata)

依据鳞翅目幼虫检索表鉴定至尺蛾科(Geometridae)，与朴美花等[5]、卢孟[6]描述的小花尺蛾幼虫形态一致。

形态特征：老熟幼虫体长20～25 mm，体表浅褐色。头部及背板红褐色，头部单眼区及颊后区有暗斑。各体节毛片明显，颜色较深。由图5可见：第一胸节(T1)，气门盾椭圆形，远离气门，着生2根上下排列的刚毛，上长下短。除第一胸节(T1)和第十腹节(A10)外，其他体节的毛片均为圆形，上面只着生1根刚毛，且相互分离。第一腹节(A1)至第五腹节(A5)，每个体节腹毛2根。第八腹节(A8)腹毛1根。第九腹节(A9)共有毛片6根，呈纵向直线排列。第十腹节(A10)，臀板上着生5根刚毛，位置可分为上下两排，上排2根，下排3根。

分子标记鉴定：将测序结果在BOLD数据库中进行比对，与库中E.abietariadebrunneata的序列相似度为99.69%，验证了形态鉴定的结果。

2.2 林口红松球果害虫发生时序

由表1可见：油松球果小卷蛾是最先入侵的害虫，6月初已经入侵红松球果，这个时候还没有见到其它害虫的踪迹。7月中旬球果中共发现4种幼虫，此时油松球果小卷蛾因大部分幼虫化蛹，数量极少(2.20%)；冷杉梢斑螟的个体最多，占总数的76.92%；小卷蛾未知种和赤松梢斑螟，各占总数的13.19%、7.69%。8月份、9月份，球果内有3种幼虫，其中2种梢斑螟的相对比例变化不大，并在数量上占优势(91.80%～94.81%)，小花尺蛾的数量较少(5.19%～9.20%)。

表1 不同采样时间球果内害虫种类及其占害虫总数比例

3 结论与讨论

同种类的幼虫个体间体色、体态变异较大，但毛序特征具有稳定性，以幼虫的毛序作为形态特征保证了种类鉴定的准确性。毛位图使鉴别特征更加直观，大幅度提高了鉴定效率。特别是林业生产单位，只需要实体显微镜就可以依据毛序特征进行幼虫种类鉴定，方便可行。

分子标记物种鉴定，不但对传统的形态鉴定有辅助和验证作用，还可以判断种群之间的谱系关系及是否存在复合种。无论幼虫形态鉴定，还是分子标记鉴定，都需要基础数据储备。本研究中，6月份受害球果中的卷蛾科幼虫鉴定油松球果小卷蛾，7月份受害球果又出现了另一种卷蛾科幼虫，现有的资料无法利用形态对其进行种类鉴定，COⅠ技术也只能暂定为小卷蛾属，有待于利用成虫特征进一步确定其种类。

从不同害虫在球果内发生时序看出，林口县小卷蛾类是红松球果的先锋种类。在6-7月份，球果体积增长期即入侵球果蛀道取食，虽然这2种害虫幼虫历期较短，但对球果的生长发育影响较大。2种梢斑螟在卷蛾之后入侵，并且数量大、发育期长，对球果种实的营养积累影响较大。小花尺蛾入侵球果较晚，在林口县发生的数量较少，危害相对较轻。

掌握幼虫发生的时序规律也有助于幼虫的鉴定。在林口县，油松球果小卷蛾6月初已经入侵红松球果，7月份会出现2种卷蛾和2种梢斑螟，其中卷蛾体色浅、毛片不明显，而梢斑螟体色深、毛片明显，故根据体色即能区分这2个类群。因7月初油松球果小卷蛾基本处于老熟幼虫阶段，体色为肉红色，体长明显高于另外1种卷蛾，由此可以区分2种卷蛾。8月份小花尺蛾开始危害，其幼虫只有2对腹足，凭借此特征可以快速地与梢斑螟区分开。但2种梢斑螟发生时间相同，体色变异大，需要依据毛序特征进行幼虫种类鉴定。

本研究表明，冷杉梢斑螟体色，大体可分为深色型和浅色型2类，其中深色型与赤松梢斑螟体色相近，并与后者一样，在体表有断断续续的深色刻点。在我国这2种梢斑螟普遍混合发生[9]，并且发生历期重合，是否存在复合种有待进一步研究确定。