七叶皂苷钠通过阻断TGF-β介导的信号通路对急性肺损伤大鼠肺纤维化和炎症因子的影响*

黄 桑，林 涛，蒙 凌，王志远，曾昭智

（1.广东药科大学附属第二医院/广州新海医院，广东 广州 510300；2.广东药科大学实验动物中心，广东 广州 510006）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是指在严重感染、休克、创伤等非心源性疾病时，肺毛细血管内皮和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。各种原因引起ALI的发病机制、病理变化和临床过程较相似，共同病理基础是：肺泡-毛细血管急性损伤，通透性增强，肺间质淤血、渗出、水肿，肺泡透明膜形成和肺泡萎缩，而造成肺通气与血比例失调，分流量增加，机体呈低氧血症、严重缺氧状态，肺部影像学为非均一性的渗出性病变[1-2]。

目前研究方向主要关注于对ALI/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）急性期的疗效及机理，而缺乏对抗肺纤维化和炎症因子干预效果和机理的研究[3]。七叶皂苷钠为七叶树果实娑罗子的提取物，其性甘、温，无毒，入脾、肺二经，有抗炎功效。本课题拟采用七叶皂苷钠干预性治疗，通过阻断转化生长因子-β（TGF-β）介导的信号通路检测急性肺损伤大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）含量变化，了解七叶皂苷钠对急性肺损伤大鼠血清炎症因子的抑制作用，了解急性肺损伤后肺纤维化的进程及程度，从而了解七叶皂苷钠对损伤肺有无肺保护作用，特别是对抑制纤维化有无作用。从而为临床治疗提供可能的新选择和研究途径。

1 实验材料

1.1 实验动物60只SPF级健康Wistar大鼠，雄性，购于中山大学实验动物中心，体质量160～200 g。许可证号：SCXK（粤）2015-2001。实验前对其进行1周的适应性喂养，保证大鼠可自由进食、饮水，维持正常的昼夜规律，设置环境湿度50%左右，温度24℃左右。大鼠所用饲料为标准饲料。

1.2 试剂与药物 强的松由仙琚制药股份有限公司生产，全称：醋酸泼尼松片，批号：150465，片剂，规格：5 mg；七叶皂苷钠注射液：山东绿叶制药有限公司，批号：160404708，规格：5 mg；IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、PCⅢ、TGF-β ELISA检测试剂盒：上海哈灵生物科技有限公司，批号：201711；油酸：天津市致远化学试剂有限公司，批号：2016110142；10%中性福尔马林：广州化学试剂厂，批号：20150722。TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒（AR1002）（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 仪器FA2004B电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司），HZT-A1000电子天平（厦门华志科学仪器有限公司），SB3200型超声波清洗机（必能信超声上海有限公司），RM23235轮转石蜡切片机（德国徕卡仪器有限公司LEICA），AE2000倒置显微镜（厦门麦克奥迪实业集团有限公司）、HCP246恒温培养箱（德国美墨尔特有限公司Memmert），3K15冷冻离心机（德国希格玛实验室离心机公司Sigma Laborzentrifugen GmbH），Infinite 200 pro酶标仪（瑞士帝肯有限公司TECAN），全自动生化分析仪Roche Hitachi917型（日本奥林巴斯株式会社Olympus），血气分析仪（美国雅培有限公司ABBOTT），Forma902超低温冰箱（美国赛默飞世尔公司Thermo Fisher）。

2 方 法

2.1 分组与造模 根据实验目的将大鼠随机分为4组：空白组、模型组、阳性对照组、实验组（七叶皂苷钠组）。给药方法：空白组经尾静脉注射生理盐水0.13 mL/kg作为正常对照，模型组、阳性对照组、实验组分别给予注射油酸0.13 mL/kg，12 h后经尾动脉取血0.2 mL，立即用手持式血气分析仪行血气分析并打印结果，以氧合指数（PaO2/FiO2）≤300为造模成功[4]。

2.2 实验给药 模型成功后实验组经尾静脉注射七叶皂苷钠注射液（4 mg/kg），空白组、模型组注射生理盐水（2 mL/kg），阳性对照组按照3.6 mg/kg的剂量给予强的松，1次/d，连续14 d，期间对大鼠活动、饮食及体重密切观察。分别于给药后第14 d处死各组大鼠，并按设计要求留取标本。

2.3 观察指标

2.3.1 大鼠肺纤维化的生理指标 测量各鼠体质量，然后用剪刀先剪去剑突处鼠毛，用酒精消毒皮肤，以3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）腹腔注射麻醉，持5 mL注射器针头行向上进针刺入心脏采血5～6 mL，离心后取血清保存至-20℃冰箱内。取肺组织：打开胸腔，分离肺组织，予电子天平称重测量。切取右肺在生理盐水中漂洗干净，置于甲醛溶液中固定，后经脱水、透明、浸蜡和包埋等制作成石蜡组织块和切片。

2.3.2 大鼠肺组织HE染色检查 石蜡切片后HE染色，光学显微镜下观察肺组织结构变化。

2.3.3 大鼠肺泡灌洗中炎症因子水平 检测肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10，检测方法主要参照试剂盒说明书。

2.3.4 大鼠肺组织信号通常分子蛋白的表达 肺组织采用免疫组化法，观察空白组、模型组、实验组3组大鼠肺组织转化生长因子β（TGF-β）、Smad蛋白2（Smad2）、Smad蛋白3（Smad3）、α-平滑肌肌动蛋白（α-sma）表达。

2.4 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件，计量资料符合正态分布以（±s）表示，采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05时表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠肺纤维化的生理指标比较 空白组大鼠外观基本正常，肺组织为粉红色，肺泡弹性良好；模型组大鼠肺组织部分呈现灰白色，实验组与阳性对照组大鼠肺脏颜色较模型组红润。模型组大鼠的肺系数、炎症程度、纤维化程度均高于其他3组（P＜0.05）。阳性对照组与实验组大鼠的的肺系数、炎症程度、纤维化程度均高于空白组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；阳性对照组与实验组大鼠的肺系数、炎症程度、纤维化程度对比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠肺纤维化的生理指标比较（±s）

表1 各组大鼠肺纤维化的生理指标比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05

组别 肺系数（mg/g） 炎症程度 纤维化程度空白组 0.46±0.05a 1.09±0.07a 0.17±0.04a模型组 1.31±0.29 3.51±0.33 6.75±0.79阳性对照组 0.49±0.07a 1.62±0.20a 0.12±0.03a实验组 0.52±0.11a 1.71±0.21a 0.18±0.10a

3.2 各组大鼠肺组织HE染色检查结果HE染色检查显示：空白组大鼠肺泡壁较薄，具有完整的肺泡结构，未发现炎症细胞浸润或充血等情况；模型组大鼠肺泡壁变厚，众多肺泡出现塌陷，部分可见融合成大肺泡，肺泡中具有明显的炎症细胞浸润或充血等情况；阳性对照组与实验组大鼠的炎症程度相较于模型组显著减轻，与空白组则无明显差异；阳性对照组与实验组大鼠的仍可保持肺泡结构尚，但肺泡间隔存在局部变厚，肺泡较少存在融合。（见图1）

图1 各组大鼠HE染色检查结果（×400）

3.3 各组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平比较 阳性对照组、实验组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10均低于模型组（P＜0.05）。实验组大鼠肺泡灌洗液中，IL-6明显低于阳性对照组（P＜0.05），两组大鼠其它指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平比较（±s，ng/mL-1）

表2 各组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平比较（±s，ng/mL-1）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与阳性对照组比较，bP＜0.05

组别 TNF-α IL-1β IL-6 IL-10空白组 77.39±15.32a 201.57±18.24a 102.47±17.49a 93.38±15.76a模型组 105.31±18.27221.71±25.47 127.16±19.83123.58±19.83阳性对照组89.75±16.57a 211.45±21.80a 114.47±15.81a 91.74±16.86a实验组 92.48±16.41a 210.07±20.94a 98.89±13.43a b 90.59±15.27a

3.4 各组大鼠肺组织TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma表达比较 模型组大鼠肺组织TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma表达均高于空白组（P＜0.05），而实验组大鼠肺组织均低于模型组（P＜0.05）。（见图2～5，表3）

表3 各组信号通路分子蛋白的表达（±s）

表3 各组信号通路分子蛋白的表达（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05

组别 TGF-β Smad2 Smad3 α-sma空白组1.521±0.202a 1.675±0.267a 1.538±0.287a 1.435±0.219a模型组3.175±0.4593.899±0.564 3.873±0.743 2.849±0.513实验组1.784±0.243a 2.243±0.0.471a 2.476±0.372a 1.998±0.234a

图2 各组大鼠肺组织TGF-β免疫组化染色结果（×400）

图3 各组大鼠肺组织Smad2免疫组化染色结果（×400）

图4 各组大鼠肺组织Smad3免疫组化染色结果（×400）

图5 各组大鼠肺组织α-sma免疫组化染色结果（×400）

4 讨论

ALI和ARDS是导致急性低氧性呼吸功能不全或衰竭的重要原因。它们共同病理基础是：肺泡-毛细血管急性损伤，通透性增强，肺间质淤血、渗出、水肿，肺泡透明膜形成和肺泡萎缩，而造成肺通气与血比例失调，分流量增加，机体呈低氧血症、严重缺氧状态[5-6]。

在急性肺损伤早期，机体通过激活中性粒细胞、巨噬细胞，以及其产生的炎症因子直接作用于肺泡膜而引起肺损伤。有研究[7]表明，ALI/ARDS时，炎症介质大量产生并相互作用，形成网络，且断循环促进，形成“瀑布样”反应，血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量明显增高。现研究已证实ALI和ARDS是由多种炎性介质及效应细胞共同参与的结果，虽然激素的规范化在炎症早期发挥着重要作用，但其最终治疗效果并不理想，死亡率依旧高居不下，不仅因为疾病进展过程迅速，而且其内在的发病机制至今尚无统一定论[8]。

肺纤维化形成是炎症因子通过作用下黏附于肺毛细血管内皮，其微血管通透性增高，进而导致肺泡渗出中富含蛋白质肺水肿及透明膜形成，同时伴有肺间质纤维化，而肺纤维化可能是导致肺功能受损的关键。肺纤维化病理过程主要包括早期损伤、炎症免疫反应、成纤维化3个阶段，虽然纤维增殖是正常的修复过程，但如果不及时干预可能会产生严重后果[9]。在细胞水平及动物模型的研究中发现，肺纤维化起源于肺损伤并伴之发展，因此在肺损伤早期实现肺纤维化形成干预，可有效的延缓及控制肺纤维化的形成。在此过程中除了涉及到巨噬细胞、中性粒细胞外，还与多种细胞因子及趋化因子密切相关，如TGF-β、TNF-α、白细胞介素（IL）、血小板源性生长因子（PDGF）、结缔组织生长因子（CTGF）、基质金属蛋白酶（MMPs）[10]。

已有研究[11-13]表明，TGF-β通过Smads通路信号转导来实现肺纤维化中I型胶原蛋白的转录和蛋白表达的调控，不仅如此，TGF-β还可通过调节MMPs、TIMPs等的表达实现对肺纤维化过程的调节。由此可见，TGF-β致纤维化形成过程的关键性纤维化因子，通过阻断TGF-β介导的信号传导通路中的某些环节来治疗或减缓肺纤维化疾病已成为人们最近研究的热点。羟脯氨酸（HYP）是机体胶原蛋白的主要成分之一，为胶原纤维所特有，其含量的变化可作为衡量胶原组织代谢的重要指标，可判断纤维化的程度[14]。

七叶皂苷钠能促进机体产生ACTH和COR，促进血管壁分泌PGF，具有类糖皮质激素抗炎、抗渗出、消肿胀作用，其能稳定血管内皮细胞和清除氧自由基，提高静脉张力，促进淋巴回流，改善微循环等，而用于治疗多种临床疾病[2]。刘朝普等[15]研究七叶皂苷钠对油酸制备急性肺损伤大鼠模型的疗效观察，通过检测PaO、W/D、血浆及肺匀浆中SOD、MDA等，结果表明不同剂量七叶皂苷钠对急性肺损伤模型大鼠均有抗炎、抗渗出作用。也有研究表明，七叶皂苷钠可显著抑制机体炎症递质的产生，清除急性肺水肿，在创伤性急性肺损伤早期应用治疗效果明显。亦有研究[16]表明，七叶皂苷钠能有效预防严重急性放射性肺损伤，而无激素类不良反应，且能提高患者生活质量。目前研究方向主要关注于对ALI/ARDS急性期的疗效及机理，而缺乏对ALI/ARDS远期（即ALI后期，抗肺纤维化）干预效果和机理的研究[17]。

本课题采用七叶皂苷钠干预性治疗，通过检测急性肺损伤大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量变化，发现阳性对照组、实验组血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10均低于模型组（P<0.05）。实验组大鼠肺泡灌洗液中，IL-6明显低于阳性对照组（P<0.05），说明七叶皂苷钠干预性治疗明显降低其炎性因子水平。通过本次对大鼠肺系数、炎症程度、纤维化程度的观察说明七叶皂苷钠能对大鼠肺纤维化的生理指标产生积极的影响，这与娑罗子的抗炎、消肿功效相吻合。HE染色检查显示空白组大鼠肺泡壁较薄，模型组大鼠肺泡壁变厚，众多肺泡出现塌陷，而阳性对照组与实验组大鼠的炎症程度相较于模型组明显减轻，与空白组则无明显差异；阳性对照组与实验组大鼠的仍可保持肺泡结构尚，但肺泡间隔存在局部变厚，肺泡较少存在融合。Masson染色检查也显示模型组大鼠双肺丧失了绝大部分肺泡结构，可见蓝色胶原大量沉积于间质，肺部实变，其纤维化程度相较于阳性对照组和实验组大鼠明显增加；阳性对照组与实验组大鼠肺泡间隔的胶原沉积情况较轻，其纤维化程度与空白组相比无明显差异。这都说明七叶皂苷钠对大鼠肺纤维化产生了积极的疗效。

大量研究[18]表明，肺纤维化的发生机制主要与早期的炎症反应和随后的纤维化增生有关。TGF-β信号通路是介导炎症反应的重要因素，很多抗肺纤维化治疗的药物都以该通路及通路中的重要分子蛋白Smad2、Smad3、α-sma表达密切相关[19]。本研究以信号通路TGF-β及关键分子蛋白Smad2、Smad3、α-sma为检测指标，发现模型组大鼠肺组织TGF-β、Smad2、Smad3、α-sma表达均高于空白组（P<0.05），而实验组大鼠肺组织中蛋白表达均下降（P<0.05）。说明七叶皂苷钠对TGF-β信号通路有明显阻拦作用。

综上，七叶皂苷钠能明显改善大鼠肺纤维化的生理指标，降低肺纤维化模型大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平，能明显抑制TGF-β/Smad信号通路，为临床治疗急性肺损伤提供了新的选择和研究途径，但其治疗机制需进一步研究。