代谢组学在反刍动物营养代谢应用中的研究进展

李胤豪 张清月 闫素梅

(内蒙古农业大学 动物科学学院/动物营养与饲料科学自治区高等学校重点实验室，呼和浩特 010018)

代谢组学自20世纪90年代末被正式提出后，检测分析手段不断完善和改进，现已在多个领域得到广泛应用，尤其在生命科学领域的应用更是热点。相较于传统研究方法，代谢组学的研究对象是小分子代谢物，可全景式地揭示机体营养物质代谢过程中的种类和数量的变化，从而探究这些变化背后的规律以及相互作用。由于代谢物的数量远远少于基因和蛋白质的数量，且不同生物体中检测到的代谢物组成相似，使得代谢组学的应用越来越广泛。近年来，在人类健康研究领域新兴起的营养代谢组学常关注某些疾病状况下的生物标志代谢物，或聚焦于疾病与饮食之间的关系，从而将代谢物与健康状况联系起来，这些成果为反刍动物营养学提供了良好的借鉴。本文主要综述了近5年来代谢组学在反刍动物瘤胃、血液和动物产品等方面的应用及研究进展，并基于代谢组学对反刍动物营养代谢机制进行了探讨，以期为代谢组学在反刍动物营养研究中的广泛应用提供参考。

1 代谢组学在反刍动物领域的研究

代谢物是驱动细胞能量生产和储存、信号转导和细胞凋亡等基本功能的底物和产物，代谢物的变化是机体内外环境、酶和各种激素以及遗传物质共同调节作用的结果，机体的生理状态与其代谢物浓度紧密联系，因此，代谢组学分析能够展示机体的全面状态和整体效应，使复杂的基因、蛋白网络研究变得简单直观。代谢组学主要关注被检测系统中相对分子质量<1 000 u的物质，通常这些物质种类繁多且化学结构复杂，例如碳水化合物、脂类、氨基酸和有机酸等。代谢组学是对某个器官、组织或环境中整体代谢物质定性和定量的综合分析，是系统生物学的重要组成部分，是生命调控的4个层次(基因组、转录组、蛋白质组和代谢组)中最直接反映机体表型的组学技术，将其应用于营养物质代谢研究，是揭示更多代谢机制进而采取调控措施的有力手段。目前，代谢组学常使用的检测平台主要包括核磁共振(NMR)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)等，常用的数据分析软件主要包括XCMS、MetAlign、MZmine、Tagfinder以及MAVEN等。

反刍动物营养学是研究反刍动物营养物质的摄入、消化代谢过程、转化利用和生命活动相互关系的科学。在反刍动物营养学研究领域，代谢组学的研究内容主要是以组织中的差异代谢物为基础，探究其与营养代谢的相关性，例如：评估瘤胃的健康状况以及营养物质在瘤胃中的代谢效率，探究影响瘤胃健康和营养物质高效利用的机制；探究血液中差异代谢物与营养代谢之间的关系，进而制定健康高效的饲养方案；基于差异代谢物探究提高与改善反刍动物畜产品(乳和肉)产量与品质的策略等。这些研究通常是在差异代谢物鉴定的基础上，对其所参与的关键代谢通路进行注释解析，从而在小分子水平上研究营养代谢机制。通过查阅近些年来被SCI收录的150余篇反刍动物代谢组学应用的相关文献(表1)发现，反刍动物代谢组学的检测对象范围较广，但主要的检测样本是血液、乳汁、瘤胃液、尿液和肌肉组织；常见的代谢物包括氨基酸、碳水化合物、肽类、脂类、能量类、核苷酸、维生素和辅助因子等。代谢物包括内源代谢物和外源代谢物，外源代谢物中又包括代谢终产物及中间代谢产物，其中大部分来自动物日粮或消化道微生物群，且代谢物之间存在错综复杂的相关性。因此，基于高通量和大数据的代谢组学充分发挥了其研究优势，极大推动了反刍动物营养学的发展。

2 代谢组学在反刍动物瘤胃营养代谢研究中的应用

2.1 瘤胃代谢组学的发展

瘤胃内代谢物的组成可以直接反映日粮营养物质在瘤胃内参与微生物代谢的规律，因此，调控并改善瘤胃微生物群落结构和代谢功能是反刍动物研究领域的重点和热点。传统的研究手段无法全面深入了解瘤胃内复杂的代谢机制，而借助于高通量的瘤胃代谢组学日益受到研究者的关注。虽然代谢组学已经广泛应用于植物学、动物学、生理学、病理学以及药理毒理学等多个领域，但目前关于瘤胃代谢组学的研究尚处于起步阶段，在Web of Science 网站中以“Metabolomics”为一级主题词检索近10年(2013—2022年)的研究文献，共有45 980余篇文献，可见代谢组学应用之广泛。再以“Rumen”为二级主题词检索共得到160篇文献，而其中近3年(2020—2022年)的文献为86篇，可见代谢组学技术在反刍动物瘤胃方面的研究并不充裕，但近年来正在蓬勃兴起。Saleem等基于前人的基础研究，于2013年建立了反刍动物瘤胃代谢组数据库(www.rumendb.ca)，其中共包含246种代谢产物。Goldansaz等于2017年将此数据库进行补充与发展，建立了家畜代谢组数据库(Livestock metabolome database，LMDB，http:∥www.lmdb.ca)，不仅将代谢物进行了分类，且对其浓度范围、化学结构以及每个代谢物在家畜健康或异常生理条件下的信息等进行了描述。这些成果为研究瘤胃内容物组成进而探索瘤胃功能提供了支持，使代谢组学在反刍动物瘤胃方面的研究应用更加便捷、全面和准确。

表1 代谢组学应用于反刍动物研究的组织样本 种类相关文献数量
Table 1 Number of literatures on the application of metabolomics to ruminant livestock sample types 篇

样本类型Sample牛Cattle绵羊Sheep山羊Capra乳汁 Milk3336血浆 Plasma2464血清 Serum1844瘤胃液 Rumen fluid1766尿液 Urine1221肌肉组织 Muscle902卵泡液 Follicular fluid300脂肪组织 Adipose tissue200粪便 Feces110精液 Semen100肝脏组织 Liver111羊水 Amniotic fluid020脑组织 Brain tissue010脑脊液 Cerebrospinal fluid010关节液 Synovial fluid010

2.2 代谢组学在瘤胃酸中毒研究中的应用

基于代谢组学研究瘤胃液、瘤胃微生物以及瘤胃上皮组织的代谢变化，可用于探讨高精料引起瘤胃酸中毒的机制。急性和亚急性瘤胃酸中毒是反刍动物生产中常见的营养代谢疾病，通常是由于摄入高水平的可发酵碳水化合物而粗纤维相对摄入不足导致乳酸过剩引起。传统的研究方法往往局限于瘤胃发酵指标和瘤胃上皮组织的变化，而不能系统地探究酸中毒生理状态下瘤胃内复杂的小分子物质的动态代谢过程以及代谢网络。近年来，瘤胃代谢组学的研究揭示了更多酸中毒的微观机制(表2)。日粮的精粗比例是引起酸中毒的决定性因素，霍文婕基于GC-MS非靶向代谢组学检测了饲喂高精料日粮的山羊瘤胃代谢物，筛选出内毒素和生物胺等78种差异代谢产物，其中，高精料日粮显著提高瘤胃中丁酸、脂多糖(LPS)、色胺、酪胺、组胺和乙酸苯酯等异常代谢产物的含量，可作为高精料日粮对山羊瘤胃产生负面影响的特征代谢产物。Zhang等以不同精粗比(40∶60和70∶30)日粮饲喂荷斯坦奶牛，基于GC-MS的非靶向代谢组学技术比较分析了瘤胃液代谢物组成，两组之间共鉴定出78种差异代谢物，主要包括有机酸、氨基酸、胺类、糖类和核苷酸等，高精料组的瘤胃液中2,2-二甲基琥珀酸、2,4-二氨基丁酸、丁酸、乳酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、生物胺(腐胺、色胺、组胺和酪胺)、LPS和乙醇胺等代谢物的含量显著增加，而4-羟基肉桂酸、肉桂酸、苯甲酸、乳糖和二羟基丙酮等代谢物的含量显著降低。Xue等基于GC-MS非靶向代谢组学的研究发现，高精料日粮组奶牛瘤胃中丙酮酸、乳酸、核糖和生物胺含量显著增加，而2,6-二磷酸果糖、柠檬酸、丁二酸、次黄嘌呤和黄嘌呤显著降低。其他一些基于代谢组学技术对饲喂高精料日粮引起的瘤胃代谢变化的研究也得出了与以上相类似的研究结果。由此可见，通常饲喂精粗比超过65∶35的日粮，容易引起反刍动物瘤胃酸中毒。在急性或亚急性瘤胃酸中毒的生理状态下，瘤胃内丁酸、乳酸、丙酮酸、内毒素、生物胺类和部分必需氨基酸等代谢物被上调，部分支链脂肪酸、糖类和嘌呤类等代谢物被下调。这些瘤胃内代谢物的变化或可作为判断反刍动物是否处于酸中毒状态的依据。此外，短链脂肪酸和乳酸的积累使瘤胃正常的发酵功能紊乱，pH长期处于5.5以下使微生物发酵底物发生变化导致正常的瘤胃微生物区系紊乱，大量革兰氏阴性菌死亡裂解，伴随着内毒素和生物胺类增多，此类物质不仅会增加瘤胃上皮细胞膜通透性、损伤瘤胃上皮细胞产生炎症反应，而且吸收入血还会加重酸中毒反应。

另一方面，基于代谢组学富集的代谢通路有助于揭示酸中毒的机制及其调控技术，例如日粮中补充丁酸盐或硫胺素等可以有效缓解酸中毒，丁酸钠可以通过抑制磷脂肌醇信号途径(PKC)和丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK)来缓解酸中毒引起的瘤胃上皮紧密连接蛋白的损伤；补充硫胺素可以通过提高丙酮酸甲酸裂解酶的活性，促进三羧酸循环途径中丙酮酸生成乙酰辅酶A，从而抑制乳酸的生成。综上所述，基于代谢组学可以发现瘤胃内反映酸中毒生理状态的生物标志物，探究这些生物标志物的变化规律并及时进行日粮调控，可以有效保障瘤胃的健康与稳态，尤其在亚急性瘤胃酸中毒发生时，在早期通过生物标志物的监测并及时干预日粮组成，可以有效保障反刍动物的健康与生产性能。值得注意的是，应用代谢组学探究高精料日粮对反刍动物影响的研究并不仅仅将检测对象局限于瘤胃液，近期的相关研究从瘤胃上皮组织入手，揭示了高精料日粮引起瘤胃内pH下降和渗透压改变可能破坏瘤胃上皮屏障，导致糖类和脂类吸收紊乱，进而对山羊的瘤胃代谢产生负面影响。

2.3 代谢组学在瘤胃发酵功能和营养物质利用效率研究中的应用

瘤胃在反刍动物的消化效率中起着核心作用，瘤胃代谢物的变化能够反映营养物质利用效率的高低，代谢组学可以为如何改善瘤胃功能或提高营养物质在瘤胃内的利用效率提供更加全面的信息。Wang等基于GC-MS非靶向代谢组学研究了茶皂素对荷斯坦奶牛瘤胃发酵功能的促进作用，结果显示添加茶皂素使瘤胃中角鲨烯、羊毛甾醇、3-苯基丙酸和瓜氨酸等代谢物浓度显著升高，通路富集结果表明，嘌呤嘧啶代谢、类固醇生物合成和酪氨酸生物合成等代谢路径在两组间存在显著差异，此类代谢通路和氨基酸与脂质的利用有关，揭示了茶皂素促进瘤胃发酵从而提高营养物质利用率的靶点。Ogunade等基于LC-MS代谢组学发现日粮添加莫能菌素可以促进荷斯坦阉牛瘤胃丙酸发酵途径，促进了瘤胃内氨循环，抑制必需氨基酸的分解代谢，有利于促进瘤胃发酵。Jin基于GC-MS非靶向代谢组学研究了奶牛瘤胃中尿素氮的代谢途径，为如何在生产中提高反刍动物瘤胃尿素利用率提供了指导。Yang等基于GC-MS非靶向代谢组学发现，日粮中玉米比例的升高导致肉牛瘤胃中营养物质利用率下降，用乳酸或盐酸处理玉米可以调节安格斯牛瘤胃淀粉的降解特性，抑制苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和苯丙氨酸代谢等关键途径从而减少有害代谢产物的产生，进而抑制瘤胃异常发酵，提高营养物质利用率。瘤胃内甲烷的产生不仅造成饲料资源浪费，还会加剧温室效应，早期的研究通过饲喂高比例的豆科牧草以降低甲烷的生成，但作用机制尚不明确。Ghamkhar等借助LC-MS代谢组学技术发现抑制瘤胃甲烷生成的关键代谢物物—乌索酸和齐墩果萜甙是豆科牧草在瘤胃中发酵产生的，为抑制瘤胃甲烷生成从而提高饲料利用效率提供了新思路。近年来的一项研究报道了瘤胃微生物门水平和属水平的相对丰度与特定瘤胃代谢物之间的相关性，试图揭示瘤胃中营养物质代谢与微生物之间的关系，但此研究只局限于特定的代谢物，并没有涉及到复杂的代谢中间产物，因此所得到的微生物与营养物质代谢之间的信息十分有限。鉴于此，应将代谢组学与微生物组学联合应用，从而提供包括微生物代谢产物在内的更加全面的瘤胃代谢信息。例如，Ogunade等基于瘤胃宏基因组学和LC-MS代谢组学联合分析研究了莫能菌素对肉牛瘤胃功能的促进作用，结果表明日粮添加200 mg/d的莫能菌素促进了革兰氏阴性菌的活性与丰度，上调了瘤胃脂质代谢和氨基酸代谢相关功能基因的相对丰度，揭示了莫能菌素通过促进瘤胃中丙酸的产生而促进瘤胃发酵，同时通过抑制氨基酸的降解途径以及调控不饱和脂肪酸的生物氢化作用来改善瘤胃功能。

2.4 代谢组学揭示高效与高产的瘤胃潜在生物标志物

瘤胃中存在着消化道最大的微生物发酵体系，瘤胃微生物可以利用饲料中的纤维素发酵为机体供能，并将非蛋白氮转化为优质的微生物蛋白加以利用。因此，瘤胃功能是决定动物生产性能的关键因素，瘤胃代谢物的变化也与生产性能紧密相连。已有文献报道指出，应用血液代谢组学研究肉牛剩余采食量从而预测饲料转化效率(Feed efficiency,FE)和平均日增重(ADG)的准确率接近95%。瘤胃代谢组学研究中也有类似的报道，Artegoitia等基于LC-MS代谢组学的研究筛选了33个与肉牛ADG差异相关的瘤胃生物标志物，其中高ADG组瘤胃中α-亚麻酸(ALA)和异油酸等含量显著降低，蝶酰-d-谷氨酸、四氧嘧啶和肉毒碱等含量显著升高，进一步通过富集通路和相关性研究得出，ALA代谢和芳香族氨基酸的生物合成是影响肉牛FE的主要功能途径。Clemmons等基于LC-MS代谢组学比较分析了高、低FE的肉牛瘤胃液代谢物，结果发现高FE组瘤胃液中柠康酸盐、琥珀酸盐、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和木糖等含量显著升高，这些代谢物除了参与碳水化合物和脂类代谢外，大多数参与遗传物质循环和蛋白质代谢，可以作为判断高FE的潜在生物标志物。同样有研究指出，不同FE的安格斯牛瘤胃中碳水化合物和脂质代谢状况存在显著差异，其中，脂类的转运和氧化途径与肉牛FE关系最密切。此外，FE还与遗传物质代谢和蛋白质合成途径有关。反刍动物高效、高产离不开对瘤胃的深入探索，代谢组学结果不仅仅局限于瘤胃发酵参数的变化，还揭示了瘤胃中脂肪酸转运、氨基酸合成以及遗传物质代谢等途径均是影响FE的因素，这些研究结果为提高FE进而提高生产性能提供了新思路。值得注意的是，最近的一项研究对肉牛的多个组织器官(包括瘤胃、十二指肠、皮下脂肪、肝脏和背最长肌)进行了非靶向代谢组学分析，结果表明，尽管肉牛各组织的分子组成具有其独特性，但ALA、磷脂酰胆碱和胆固醇是各组织共有的差异代谢物，这些可以被认为是与肉牛生产性能有关的生物标志物，且脂质的合成、运输和氧化是肉牛日增重和FE差异的共同代谢途径。这项研究也展示了代谢组学在多组织器官研究中的优势，能更精准地发现影响高效生产的主要因素，进一步结合靶向脂质代谢组学，可能会揭示更加全面的脂类代谢与FE之间的关系。

基于代谢组学可以探究高产和低产奶牛瘤胃代谢物组成的差异。Mu等基于LC-MS非靶向代谢组学的研究表明，高产奶牛瘤胃中包括6-氟辛基-4-乙烯酮等10种代谢物浓度显著增加，通路富集结果表明高产奶量与体内不饱和脂肪酸生物合成、甾体生物合成以及萜醌生物合成代谢途径上调有关，而产奶量降低可能与核苷酸代谢、能量代谢和脂质代谢途径被抑制有关。Zhang等基于LC-MS非靶向代谢组学的研究表明，高产奶牛瘤胃中包括龙胆酸，辛酸和肉豆蔻酸等30种化合物含量显著增加，而羧酸以及二氮杂苯类化合物等24种代谢物含量显著下降，通路富集分析显示蛋白质的消化吸收、ABC转运体和不饱和脂肪酸的生物合成等差异可能是影响产奶量的最主要代谢通路。上述研究表明，产奶量的增加必然伴随着糖类、脂类和蛋白质消耗的增加，传统的研究方法集中于调控乳糖、乳脂和乳蛋白合成的相关途径，而代谢组学可以提供更加全面的代谢信息，例如高低产奶牛瘤胃中某些酮类、醚类和萜类代谢物的代谢途径存在显著差异，这在以往的研究中可能会被忽略。且一个重要的因素应该被考虑，即高产奶牛往往处于能量负平衡状态，这可能伴随着机体亚健康或疾病状态。因此，反映高产奶量的生物标志物也可能是疾病状况下的生物标志物，例如高产奶牛发生酮病或乳热症时也伴随着瘤胃内酮类和游离脂肪酸的代谢异常，此类状况下基于代谢组学的结果则需进一步分析与讨论。

日粮组成是影响产奶量的主要因素，Sun等基于GC-MS代谢组学比较了以苜蓿草或玉米秸秆为主的日粮对奶牛产奶量的影响，结果发现饲喂低质量的玉米秸秆使瘤胃中琥珀酸生物合成途径显著下调，而琥珀酸是丙酸生物合成的重要中间代谢物，提示饲喂低质量粗饲料可能抑制瘤胃丙酸发酵从而降低产奶量。Xue等基于GC-MS代谢组学比较了产高乳蛋白乳和低乳蛋白乳的荷斯坦奶牛瘤胃代谢物，结果发现高乳蛋白奶牛组瘤胃中有25种代谢产物浓度显著升高，且通路富集结果提示，维生素B代谢、甘油脂类代谢和β-丙氨酸代谢可能是调控乳蛋白合成的关键途径，同时，该作者又利用瘤胃宏基因组学与代谢组学联合分析，发现特定的微生物类群(主要为多个普雷沃氏菌种)和参与谷胱甘肽、苯丙氨酸、淀粉和半乳糖代谢的氨基酸呈显著正相关，表明普雷沃氏菌可能显著影响宿主的氨基酸合成从而影响乳蛋白含量。综上，基于瘤胃代谢组学可以揭示反刍动物高产与低产、高效与低效生产差异的潜在机制；与生产性能密切相关的生物标志物为通过营养调控提高生产性能提供了新的研究思路；整合多种组织的代谢组学分析为探究影响生产性能差异的分子机制提供了更加全面的信息；基于非靶向代谢组学找到研究方向，靶向代谢组学是进一步验证与补充研究结果的重要手段；瘤胃微生物组学与代谢组学的关联应用可以从微生物角度解释差异代谢物与生产性能的关系。

3 血液代谢组学在反刍动物营养代谢研究中的应用

3.1 血液代谢组反映反刍动物的代谢状况和营养水平

血液遍布机体内各组织器官，参与体内绝大部分新陈代谢过程，与瘤胃中复杂的微生物发酵不同，血液代谢物的波动能够实时反映动物的代谢状况和营养水平，进而指导科学的饲养管理。因此，将血液作为代谢组学的检测对象来研究反刍动物营养代谢机制是研究者们的首选。Zhang等基于GC-MS代谢组学比较了过度与适度放牧的绵羊血清中代谢物的组成，鉴定出15种主要的差异代谢物，其中，过度放牧组次黄嘌呤等9种代谢物浓度显著升高，硬脂酰肉碱等6种代谢物浓度显著降低，代谢路径富集分析表明过度放牧组绵羊机体脂肪酸氧化、胆汁酸生物合成以及嘌呤代谢显著增强，而蛋白质的生物合成被抑制。这些差异代谢物以及代谢通路的发现有助于研究工作者对过度放牧条件下绵羊生长性能下降的分子机制的理解，为科学放牧提供理论依据。Zhang等基于GC-MS代谢组学研究了不同的自然光照时长对绒山羊血浆代谢物的影响，发现每天接受7 h以下的光照使绒山羊血浆中丝氨酸、草酰乙酸、木糖、左旋多巴和黄嘌呤含量显著上升，肉毒碱、1,3-二氨基丙烷、吲哚乙酸和L-犬尿酸含量显著下降，提示短期光照使绒山羊氨基酸分解途径增强，氮利用率降低。Xu等基于LC-MS代谢组学探究了奶牛泌乳早期能量负平衡与血浆和乳中代谢谱之间的关系，结果表明，血浆与乳中共有9种代谢物相互关联且与能量平衡有关，主要涉及高血酮症、脂肪酸氧化和单碳化合物代谢等生理途径，此结果为判断泌乳牛能量平衡状态提供新的参考。Guo等分别用甘油和过瘤胃保护的氯化胆碱饲喂因妊娠期限饲而营养不良的母羊，基于LC-MS检测血液中的代谢产物，结果表明营养不良导致母羊体内脂质和氨基酸被动员，引起机体脂质代谢、氨基酸代谢和三羧酸循环紊乱，而日粮添加甘油和过瘤胃氯化胆碱均能抑制这些代谢物的变化，两者均可缓解妊娠母羊营养不良带来的负面影响，此项研究也为人类预防和治疗妊娠期间营养代谢疾病提供了参考。

3.2 血液代谢组揭示高效、高产、健康与疾病状况下的代谢差异

血液代谢物的变化可以与家畜营养状况、健康体况以及生产性能等表型相关联，为研究反刍动物营养提供新的见解。Clemmons 等基于LC-MS血清代谢组学发现硬脂酸、马尿酸、泛酸盐和肉碱等代谢产物的相对含量与肉牛的FE显著相关，由此可以预测肉牛的长期饲养状况。Karisa 等基于NMR代谢组学技术探究了肉牛血浆中与生产性能密切相关的代谢物，筛选出肌酸、马尿酸和肉毒碱3种与剩余采食量呈显著正相关的代谢物，可作为生物标志物来预测牛群采食量信息。Novais等基于LC-MS代谢组学对比分析了高、低FE 的肉牛血清代谢物，发现视黄酸、孕酮、硬脂酸、吐叶酸、2,3-二氢黄酮、植酸和柠檬酸等代谢物与肉牛FE显著相关，通路富集分析发现维生素A代谢途径可能是影响肉牛FE的最关键途径之一。类似地，Elolimy等基于LC-MS代谢组学发现犊牛的生长速度和FE与后肠道所能吸收的维生素和必需氨基酸有关，高FE组犊牛消化道维生素A、维生素B、维生素B以及部分氨基酸的和合成和转运等途径显著上调，考虑到犊牛自身无法合成某些维生素与氨基酸，造成这些代谢途径变化的原因可能是犊牛的遗传背景以及来自母乳的微生物组成不同有关。值得注意的是，血液和瘤胃中反映高效高产的生物标志物组成可能不同，这提示了综合多组织代谢组学研究的重要性。由以上研究报道可知，代谢组学不仅提供了更多调控FE的生物代谢途径，也有助于指导我们利用生物标志物识别与筛选能高效利用饲料的动物，从而在早期实现更合理的饲养管理。

与传统的血液生化指标相比，代谢组学表征的小分子物质能够更加系统地反映生理健康状况。Dervishi等基于GC-MS代谢组学发现了奶牛发生胎衣不下时血清中的23种生物标志物，其中生物胺、赖氨酸、乙酰鸟氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和磷脂酰胆碱等代谢物的含量在产后胎衣不下的牛群血清中显著升高。有研究指出，在代谢组学检测中，血浆是一种相对更好的材料，血浆从血细胞中分离出来的速度比血清从凝血块中分离出来的速度快，而且血浆在凝血过程中受到血细胞释放的代谢物和酶污染的影响较弱，因此，血浆是更常见的代谢组学检测材料。Xu等基于H-NMR代谢组学对患脂肪肝奶牛血浆进行分析，发现谷氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、三甲胺叠氮、β-羟丁酸和丙酮含量显著升高，而丙氨酸、γ-氨基丁酸、肌酐、天冬酰胺、丙三醇和葡萄糖含量显著降低，以上代谢物可作为预测奶牛脂肪肝的生物标志物，且由此推测，氨基酸和脂肪酸代谢以及糖异生途径的紊乱是奶牛脂肪肝时的主要异常代谢特征。Dervishi等基于GC-MS代谢组学技术持续监测围产期患有亚临床乳房炎的奶牛血浆代谢物的变化，结果发现，从产前8周开始血浆中支链氨基酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的含量开始显著升高，且该状态持续至产后8周，此类氨基酸可作为判断亚临床乳房炎的生物标志物，其参与的氮代谢和蛋白质生物合成等途径的异常变化是奶牛乳房炎早起临床诊断的有力依据。奶牛采食黄曲霉毒素污染的饲料后会导致肝功能受损，生产性能下降。Ogunade等基于H-NMR代谢组学的研究表明，摄入黄曲霉毒素使奶牛血浆丙氨酸、亮氨酸、精氨酸和乙酸浓度显著降低，氨基酸代谢紊乱，且黄曲霉毒素通过抑制乙醇脱氢酶活性降低肝脏分解乙醇的效率，使血浆中乙醇浓度较健康对照组升高3.56倍，乙醇可作为肝脏损伤的重要标志物；该研究还指出，日粮添加钠基膨润土可有效缓解黄曲霉毒素引起的肝脏损伤。传统的研究方法集中于血液生化指标，其结果信息十分有限，而代谢组学可以发现并掌握众多生物标志物的变化规律，不但能指导早期预防或治疗某些营养代谢疾病，还能帮助发现机体调控营养代谢的路径。然而，大多数基于非靶向代谢组学所筛选的生物标志物都是相对定量的结果，缺乏绝对定量的数据，由于各检测平台以及分析手段的不同，这些结果无法进行有效整合。因此，结合靶向代谢组学的精准研究策略能够得到更加可靠的结果。

4 代谢组学在反刍动物乳成分合成机制研究中的应用

4.1 健康或疾病状况下乳中差异代谢标志物

代谢组学不仅能评估乳及乳制品的品质与安全，还可以追溯产奶动物的营养状况、健康体况和遗传品系等信息。例如，患亚临床型乳房炎的奶牛所产的乳中乙酸乙酯和乙酸等挥发性代谢产物的含量显著升高。患临床型乳房炎的奶牛所产的乳中神经酰胺、硫胺素、5-氨基咪唑和胆碱磷酸等10种代谢物存在显著差异，且通路富集结果表明，鞘脂类代谢通路被上调，而硫胺素代谢、嘌呤代谢、甘油磷脂代谢和甲硫氨酸代谢等7条代谢通路被抑制，这些代谢物可以作为筛查和追溯奶牛乳房健康状况的标志物。Tian等先后利用LC-MS和NMR代谢组学技术对奶牛热应激造成的亚健康状况进行了研究，筛选出53种差异代谢物，其中，热应激组乳和血浆中柠檬酸以及柠檬酸盐的含量显著升高，可以作为诊断热应激的重要生物标志物。最近关于奶山羊的一项代谢组学研究也发现，热应激组的山羊乳中柠檬酸的含量显著升高，可见热应激反应与柠檬酸循环密切相关；该研究还发现另一种重要的生物标志物是胆碱，热应激状况下，乳腺免疫系统中的胆碱能信号通路被激活，刺激乳腺合成大量胆碱，而胆碱的浓度与炎症反应时分泌的急性期蛋白浓度显著正相关，由此可以判断热应激会导致或加重乳房等局部的炎症反应。上述基于代谢组学的研究揭示了疾病发生后乳中代谢物的变化规律，为今后利用生乳快速检测与判断产乳家畜是否处于亚健康或疾病状况并及时采取相应的预防与治疗措施提供了重要的理论依据。

4.2 基于代谢组学研究营养干预对乳成分及乳品质的影响

营养干预是调控产奶量及乳品质的有效手段，借助代谢组学技术可以更全面地揭示日粮对产乳的影响机制。例如，饲喂不同类型的牧草或全混合日粮，对奶牛瘤胃液和乳中代谢物组成影响显著，基于代谢组学的结果显示，二甲砜和马尿酸可能是乳中区分不同饲喂方式的生物标志物。饲喂不同品质的农副产品对产奶量和乳品质也会造成影响，Sun等分别以优质苜蓿草和玉米秸秆饲喂奶牛，基于GC-MS代谢组学技术检测乳中的差异代谢物，结果表明，以玉米秸秆为主的日粮显著下调了泌乳过程的3个代谢节点(丙酮、葡萄糖和氨基酸)的代谢物浓度，且发现马尿酸是乳品质降低的生物标志物，乳中马尿酸含量升高可能与营养摄入不足或肝功能损伤有关。霉菌污染严重影响乳品质，尤其对于黄曲霉毒素摄入后乳中生物标志物的鉴定迫切需要，研究发现摄入黄曲霉毒素主要改变了乳中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成以及精氨酸、脯氨酸代谢等途径，乳中氨基酸代谢紊乱是黄曲霉中毒的重要标志。代谢组学有利于研究工作者更深入地认识霉菌毒素对反刍动物的危害，并从微观指标评估霉菌毒素污染对乳品质以及人类健康的威胁。基于代谢组学对泌乳生理过程进行全面追踪，进而破译调节产奶量及乳品质的生物学过程，是当代全球奶业发展的新驱动。

4.3 追溯乳品来源

利用代谢组学可以检测不同来源的乳中特定的小分子物质，将有助于追溯乳品来源、鉴定乳品安全与品质以及评估乳制品加工方法的合理性。Caboni等基于LC-MS代谢组学比较了绵羊和山羊乳中代谢物的组成，结果显示，绵羊乳中含有较高水平的柠檬酸、甘油酸、α-酮戊二酸、阿拉伯糖醇、肌醇和甘氨酸，而山羊乳中的亮氨酸、焦谷氨酸、缬氨酸、甘露糖-6-磷酸盐、异麦芽酮糖和岩藻糖含量较高。Scano等基于LC-MS代谢组学发现羊奶和牛奶中糖类 (主要包括:葡萄糖、果糖、核糖、塔罗糖)和氨基酸(甘氨酸、缬氨酸等)的含量存在显著差异，并根据此结果，结合多元回归统计学方法，将含有5%牛奶的羊奶与纯羊奶成功区分开。另一项研究基于LC-MS代谢组学比较了3种不同品种的水牛乳中代谢物组成，结果显示与脂肪酸合成和甘油三脂代谢有关的11种代谢物在3种乳中存在显著差异，由此推测脂类代谢不同可能是区分不同牛乳成分的重要依据。与之类似，Murgia等基于LC-MS代谢组学比较了由绵羊奶和山羊奶发酵制成的酸奶，发现两种不同来源的酸奶中氨基酸及其衍生物、有机酸和糖类等的含量具有显著差异，且由山羊奶发酵制成酸奶的过程中小分子物质变化更显著，营养价值更高。综上所述，代谢组学是研究乳及乳制品生产和变化内在机制的重要手段，将有助于改善反刍动物产品的生产流程。值得注意的是，尽管代谢组学在乳及乳制品研究中存在明显的优势，可以直观地将代谢物与生理功能联系，但乳及乳制品生产涉及到基因、转录、蛋白质翻译和代谢物等不同水平的共同参与，因此，为更清楚地了解代谢物与乳品质的关系，需要借助多组学技术(基因组学、宏基因组学、转录组学和蛋白质组学等)联合分析，这可能是未来乳品科学研究领域的必然趋势。

5 代谢组学在反刍动物肉品质研究中的应用

肌肉代谢产物是决定肌肉生理特性和肉品质性状的主要因素，利用肌肉代谢组学能识别潜在的调控肉质的生物标志物从而揭示肉质发生变化的机制。肌肉代谢物受动物的品种、生长发育状况、饲养模式、部位、宰后肉类氧化作用以及加工生产等过程的影响，例如，就品种而言，基于GC-MS代谢组学可以通过区分不同物种(肉牛、猪、鸡)的肌肉代谢物所存在的差异，进而鉴定肉制品来源。Jeong等基于NMR代谢组学的研究表明，癸酸和谷氨酰胺的含量差异可能是区分荷斯坦奶牛和日本和牛肉的重要依据，从而为鉴别肉类掺假提供帮助。就部位而言，Ma等基于LC-MS代谢组学研究了牛不同部位的肌肉品质，发现背最长肌中脂乙酰-肉碱、肌肽和鹅肌肽的含量显著高于半膜肌和腰大肌，其中肉碱的分解代谢产物苹果酸是维持肉色稳定的重要物质，而肌肽和鹅肌肽都可以通过螯合过渡金属元素表现出抗氧化活性，由此判断背最长肌具有更佳的肉品质与抗氧化能力。类似的一项基于LC-MS靶向代谢组学的研究也表明，屠宰后的牛背最长肌和腰大肌的能量代谢模式不同，有22种与能量代谢相关的代谢物在两种肌肉中存在显著差异，相较于背最长肌，腰大肌存在更强的三羧酸循环，其氧化作用也更加剧烈，因此推测背最长肌肉品质更稳定也更易贮存。Subbaraj等基于LC-MS代谢组学的研究表明，屠宰后羊肉肉色的稳定性与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)、左旋-蛋氨酸、磷酸糖、牛磺酸和鸟苷-苹果酸络合物等具有抗氧化功能的内源性代谢产物有直接关系。宰后肉类发生的氧化作用导致肌肉品质下降，Muroya 等追踪了杂交阉牛背最长肌中的代谢物在宰后14 d内的变化过程，发现胆碱、烟酰胺和硫胺素等含量随时间推移发生显著变化。另一项基于代谢组学的研究发现，肌肉中亮氨酸含量与宰后时间呈正相关，而肌酸含量与宰后时间呈负相关，二者可作为肌肉老化的生物标志物，以上研究表明代谢组学有助于按氧化时间对肌肉样品进行分类。

饲养模式是影响反刍家畜肉品质的重要因素，Carrillo等基于LC-MS和GC-MS代谢组学综合分析的结果表明，高精料饲喂的安格斯牛背最长肌中n-3 PUFA含量低于高粗料组，而n-6 PUFA含量高于高粗料组，且部分呈味氨基酸(如谷氨酸等)的含量低于高粗料组，该研究还发现高粗料组肌肉皮质醇水平较低，表明该组牛受到的应激较小，而应激反应也是导致肉品质下降的关键因素。Wang等基于代谢组学比较了舍饲和人工草场放牧两种育肥模式下滩羊肌肉代谢物的变化，结果发现放牧组羊肉中谷氨酸、脯氨酸、ALA和肉碱含量显著升高，而组氨酸、花生四烯酸、亚油酸、肌肽和肌酐含量显著降低，上述差异代谢物主要参与了氨基酸和脂质代谢，且均与羊肉的营养功效和风味有关，表明放牧的滩羊肉具有更好的营养价值与肉品质。该研究将LC-MS非靶向与靶向代谢组学相结合，其目的是以靶向代谢组学来验证和拓展非靶向代谢组学的结果，从而更深入和全面理解肌肉中代谢物的变化规律。综上，肌肉代谢组学是肉类质量分析和品质鉴定的有力工具，有望在改善动物肉品质及探究其分子机理方面提供帮助。值得注意的是，与肉品质相关的生物标志物的发现多是基于非靶向代谢组学的相对定量结果，而可以绝对定量的靶向代谢组学数据才可以用于制定判断肉品质优劣的标准。因此，基于代谢组学得到的影响肌肉理化特性的生物标志物如何开发利用，其含量标准如何制定等问题都有待进一步解决。

6 小结与展望

目前，代谢组学在营养代谢研究中的应用大致分为两大主题: 筛选生物标志物和发现生理机制。鉴于此，本文从反刍动物营养学领域综述了近5年来以瘤胃、血液以及乳和肉类等为目标的代谢组学研究进展，例举了不同生理状况下的瘤胃、血液、乳和肉类中的生物标志物，并基于代谢组学结果探讨了营养代谢的部分机制，为反刍动物的科学饲养、健康和高效生产及乳、肉品质的改善提供参考。代谢组学技术的整体性和动态性等特点与机体营养物质的代谢特点一致，从而有助于推动反刍动物营养学领域的快速发展。但目前还存在一些限制因素：一方面，仅凭借一种检测手段很难同时收集到所有代谢物的数据，随着时间的推移，现有的已知代谢物列表也需要不断添加与更新更多的代谢物信息；再者，代谢组学所获得的代谢物往往种类繁多，若要更进一步筛选和挖掘所关注的信息，就需要具备扎实的生物信息学技能，借助数学、统计学和生物化学等手段，利用全面而准确的生物信息数据库，进行多学科之间的交叉关联。因此，构建更完善的检测与分析技术平台，同时提高研究者自身的科研能力，将有助于代谢组学在反刍动物营养研究领域取得更大突破。

随着微生物组学、宏转录组学、蛋白质组学和金属组学等技术的发展，多组学联合分析已成为新的研究趋势。从基因到表型的衍化过程涉及多条代谢途径，其中消化道微生物的参与使代谢机制更加复杂，将代谢组学与微生物组学相结合，从微生物代谢角度揭示复杂的营养代谢机制，是当前研究的热门思路。希望后续通过多组学技术的联合应用，能够更有效地进行数据整合，进一步拓宽研究者的视野，更好地推动系统生物学的发展。