LED光源蓝光成分介导小鼠视网膜的损伤作用

刘语涵 高秀娟 王圣珺 王家璐 马凤銮 王泽辰 丁高峰 孙子昂 孙 晖 张 君4

1 滨州医学院第一临床医学院 山东 滨州 256603； 2 滨州医学院第二临床医学院 山东 烟台 264003；3 滨州医学院基础医学院 山东 烟台 264003； 4 滨州职业学院 山东 滨州 256600

发光二极管(light emitting diode，LED)光源因其节能、耐用等优点在日常生活中被广泛应用。照明LED光源是以GaN芯片和钇铝石榴石组成，通过GaN芯片发出蓝光(465 nm)激发钇铝石榴石荧光粉后混合得到常见的复色白光[1]，因此，与传统灯源比较，LED光源含有更多蓝光成分[2]。神经节细胞对蓝光非常敏感[3]，短波蓝光更容易造成视网膜细胞的损伤[4]。蓝光对视网膜的危害主要表现为色素上皮细胞和感光细胞的病理变化，包括细胞空泡样变、线粒体肿胀、微绒毛减少[5]、细胞凋亡[6]及视网膜功能相关蛋白表达水平的下降[7]。虽然目前LED光源采取了消减蓝光光谱的保护性措施，符合国家有关标准，但照明LED光源对视网膜的损伤，特别是对视网膜神经节细胞的损伤还缺乏关注。随着LED光源在室外和室内照明中的普及，探讨其对视网膜特别是视网膜神经节细胞的损伤非常必要。本研究拟通过利用自然光、日光灯、LED灯及蓝光灯分别照射小鼠，观察其对视网膜各层厚度和视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)密度变化的影响，进而评估不同光源，特别是LED光源对视网膜细胞是否构成损伤，为今后LED光源暴露损伤视网膜的研究和蓝光损伤预防提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 动物 7周龄健康雄性昆明种小鼠，购自于济南朋悦研究动物繁育有限公司。动物房室内通风良好，使用标准饲料(济南朋悦研究动物繁育有限公司)喂养，自由饮水进食，室内照明光源(白炽灯)调节日夜节律(12 h开，12 h关)，1周后进行实验。本研究过程符合滨州医学院动物保护伦理委员会的相关要求。

1.2 方法

1.2.1 动物光照模型的制备 将小鼠置于50 cm×50 cm旷场中(旷场正上方放置可调节高度的灯架)，分别给予室内光源(521 Lux)、LED光源(35 W灯带，欧普照明，中国)、470 nm蓝光光源(15 W灯带，三燿照明，中国)、日光灯光源(50 W灯条，欧普照明，中国)暴露。先将60只小鼠随机分为6组，每组10只；将各组小鼠分别置于6个旷场中，LED光源照射时间(12 h/d)分别为0、3、6、9、12、15 d。另取48只小鼠随机分为4组，每组12只，分别置于4个旷场中，给予室内光源、日光灯光源、LED光源、蓝光灯光源暴露(12 h/d)15 d。为保证光强度与室内光强度一致，利用光谱照度计(SPIC-300AW，中国远方)在研究前及过程中检测旷场中光强度，调节灯架高度使日光灯光源、LED灯光源光强度与自然光一致(510～530 Lux)，调节蓝光灯光强度与LED光源蓝光光强度相一致(156 Lux)。

1.2.2 标本制备 采用颈椎脱臼法处死小鼠后，取光照模型小鼠眼球置于4%中性甲醛中固定过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，65℃液体石蜡中浸泡过夜。浸蜡后按照染料标记方向上的矢状位水平包埋，冷却后在4℃冰箱保存。经视神经进行石蜡切片，厚度为4 μm，70℃烤箱烤片30 min，进行HE染色，脱水后用中性树胶封片，400倍光学显微镜(Olympus CX31)下拍摄视神经旁开2 mm视网膜。

1.3 观察指标 选取经过视神经的切片旁开2 mm拍照，使用image J测量，并记录视网膜总厚度、内核层(inner nuclear layer，INL)、外核层(outer nuclear layer，ONL)、感光细胞层厚度及同视野下视网膜神经节细胞数量(160 μm内)。

2 结果

2.1 LED灯照射不同时间对视网膜的损伤的影响 阴性对照组的小鼠视网膜细胞形态基本正常，排列规整，分界清楚。神经节细胞单行整齐排列，局部可见小血管。INL细胞由6～7层重叠排列的双极细胞核组成，核染色较浅。ONL细胞由约10层重叠排列的感光细胞核组成，核染色较深。感光细胞层细胞内外节完整，内节较粗，染色深，而外节较细，染色浅(图1)。此后，每三天取材观察小鼠视网膜的变化，包括测量RGC密度，视网膜全层、INL、ONL、内丛状层(inner plexiform layer，IPL)厚度等。视网膜层厚度、INL、ONL、IPL厚度均在LED光源暴露第6天开始变薄(与对照组比较，P<0.05)，RGC密度在LED光源暴露第9天开始减小(与对照组比较，P<0.05)。这些变化在LED光源暴露第12天逐渐稳定，第15天视网膜损伤与第12天比较没有改变(表1)。因此，本研究后续LED光源暴露时间均采用15 d。与第0天比较，第15天时RGCs皱缩，胞质嗜酸性变，细胞排列疏松。核大小不一，可见核固缩、核碎裂、核溶解，有残存细胞空泡。IPL、INL、ONL层厚度变薄。INL和ONL细胞密度降低，边缘不整，部分细胞凋亡。而感光细胞层(photoreceptor layer，PRL)部分细胞外节丢失，细胞疏松、形态不规则(图1)。

GCL.神经节细胞层；IPL.内丛状层；INL.内核层；ONL.外核层；PRL.感光细胞层。

表1 LED光源暴露不同时间视网膜厚度RGC密度统计

2.2 不同光源照射对视网膜的影响 为进一步验证LED光源对视网膜的损伤是通过其蓝光照射导致，本研究使用不同光照射15 d观察其对视网膜的损伤情况，不同光包括自然光、日光灯、LED灯、蓝光灯。与自然光照射比较，日光灯组视网膜总厚度、INL、ONL和IPL厚度均没有明显变薄，RGC密度也没有明显改变，P>0.05，而蓝光灯组视网膜总厚度、INL、ONL和IPL厚度明显变薄，RGC密度也明显降低，P<0.05(表2)。视网膜HE染色显示，蓝光灯组小鼠RGCs出现细胞排列疏松、核固缩，嗜酸性粒细胞增多等病理损伤表现，还出现凋亡后残余细胞空泡。蓝光灯组INL、ONL也出现病理损伤，包括细胞层数减少、排列紊乱，边界不齐，而PRL部分细胞外节丢失，细胞疏松、形态不规则(图2)。

GCL.神经节细胞层；IPL.内丛状层；INL.内核层；ONL.外核层；PRL.感光细胞层。

与自然光比较，LED光源暴露对视网膜的损伤出现于视网膜全层，INL、ONL和IPL厚度变薄，RGC密度降低，P<0.05(表2)，这与蓝光照射对视网膜的损伤相似。这些结果提示，LED灯对视网膜的损伤主要是其蓝光光谱作用的结果，与其他光谱照射无关。另外，LED光源暴露对视网膜全层、IPL厚度及RGC细胞密度的影响较蓝光暴露小(P<0.05)，而INL和ONL层厚度则没有明显区别(P>0.05)。这提示LED光源对视网膜的损伤作用比单纯蓝光更弱，这可能与LED光源其他光谱成分的作用有关。

表2 不同光源暴露15 d视网膜厚度与RGC密度统计

3 讨论

目前，LED光源被广泛应用，随着LED灯的迅速普及，家用LED灯导致的视网膜损伤逐渐引起重视。Koide等[8]最早进行了LED产生的蓝光对猕猴视网膜损伤的研究，发现LED光源刺激时间超过40 min即可造成视网膜干细胞的破坏。南莉等[9]使用500 lux的LED光源照射7 d即可造成大鼠视网膜细胞损伤，细胞凋亡相关基因 Bax、Caspase-3 促进光损伤的发生与进展。200 lux的蓝色LED光源照射1个月会导致凋亡相关cleved-PARP蛋白的表达水平增加，而绿光、红光LED照射组没有观察到相似变化。

蓝光的色素光谱吸收峰值与线粒体相似，可能是导致线粒体的破坏和氧自由基的增加的直接因素[10]。此外，视紫红质介导的光化学损伤、色素上皮细胞代谢产物的积聚、脂质过氧化、氧自由基的破坏作用、细胞因子表达改变等也可能是视网膜光损伤的相关因素[11]。本研究发现，在不同时长的LED光源暴露下，第6天视网膜即开始出现病理损伤变化，第15天损伤达到稳定状态，视网膜各层厚度减少是其损伤主要组织学表现，INL、IPL和ONL厚度减小。本研究还发现，RGC也出现损伤，主要表现为细胞核的固缩、凋亡小体出现和细胞密度的降低等病理表现，并且与LED光源暴露时长呈正相关。RGC在形成视神经动作电位的过程中至关重要，而其损伤与神经元类似具有不可再生性，其对视力的影响尤为重要。本研究结果显示，长期LED光源暴露对RGC可形成不可逆性损伤。这提示，LED光源可能存在损伤视力的潜在风险，将在下一步的研究中明确其损伤机制及其预防的方法。本研究还利用不同光源暴露发现，蓝光暴露造成的视网膜损伤与LED光源暴露相似，这提示目前LED光源对蓝光的屏蔽效果还需进一步改进。另外，与蓝光暴露比较，LED光源暴露在视网膜全层厚度、IPL厚度和RGC细胞密度等方面损伤较轻。这提示，LED光源与蓝光暴露对视网膜的损伤并不完全一致，LED光源中其他光谱成分可能也会影响视网膜光损伤。LED光源蓝光成分的其他作用也被发现。张丽敏等[12]发现，高糖环境下低能LED光照可以起到抗细胞凋亡的作用，提示光生物调节可能成为治疗糖尿病视网膜病变的辅助治疗手段。Wright等[13]发现，470 nm的蓝色LED光源可调节褪黑素分泌，可以调节昼夜节律。严永红等[14]发现，LED照明在工厂作业中同样具有优势，被试者疲劳度下降，视觉灵敏度和认知能力与对照组比较均有提高[14]。因此，LED光源中蓝光成分对机体的影响还需进一步探讨。

此外，LED光源的色温、频闪也是视网膜致伤原因。高色温LED灯可刺激活化相关信号通路，干扰色素上皮细胞炎性因子的分泌[15]。由于LED灯的正向伏安特性导致其频闪现象明显多于传统光源，光源频闪频率的增高可损害视网膜功能[16]。

由于啮齿动物视网膜与人存在差异性，其对LED光源暴露造成的影响也与人的视网膜存在差异。Sliney[17]发现，大鼠视网膜在相同灯光亮度下接受的辐射照度比人视网膜接受的辐射照度高出60%。这提示，本研究需要通过临床相关病例进一步研究。

综上所述，LED光源暴露时间与视网膜损伤呈正相关，并且其对小鼠视网膜的损伤与蓝光暴露造成的视网膜损伤相似。日常LED光源中蓝光光谱对视网膜的损伤作用需要引起重视。