外源C4-PEPC对水稻粒形和稻米品质及成分的影响

连 玲，吴春珠，何 炜，郑燕梅，魏林艳，蔡秋华，谢华安，张建福

(1福建省农业科学院 水稻研究所，福建 福州 350018；2农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室，福建 福州 350003；3福州(国家)水稻改良分中心，福建 福州 350003)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)广泛存在于维管植物、原生动物、蓝藻、绿藻、非光合细菌和古细菌中[1-2]，在植物细胞中主要参与光合碳同化等重要代谢途径，并且在不同组织中具有多种生理功能[3]。在C4和景天科植物中，PEPC的主要生理作用是固定原初二氧化碳(CO2)，催化碳的同化；但在非光合作用组织及C3植物中,PEPC是三羧酸循环(TCA循环)回补代谢途径的关键酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与HCO3-反应生成草酰乙酸(OAA)，此反应不可逆，而产物OAA是TCA循环的重要原料[1]。与 C3植物相比， C4植物的光合效率高，CO2补偿点低,光呼吸弱,其主要原因是由于最初固定 CO2的关键酶PEPC对CO2的亲和力强，并起到 CO2泵的作用，同时能有效抑制核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的加氧活性，降低光呼吸能力[4-6]。科学家们设想将C4光合作用途径引入C3植物，并进行了将C4型植物PEPC导入到C3植物的研究。因此，全面分析C4-PEPC在C3植物水稻中的作用，可为C4型基因更好地应用于C3植物奠定必要的理论基础。

目前，有关将C4型基因导入C3植物的研究较多。Ku等[7]将完整的玉米PEPC转入水稻，发现转基因水稻中PEPC活性明显提高，光氧化减弱，但光合速率变化不明显；而后来的研究发现，导入玉米PEPC后水稻的光合速率有不同程度提高[8-10]，气孔导度增加，CO2吸收速率和羧化效率提高，CO2补偿点略有降低[11-13]；导入高粱、甘蔗或稗草PEPC后，水稻植株的光合速率也有所提高[14-16]。另外，水稻中转入PEPC基因后，PEPC可以激活清除活性氧的关键酶，从而有效清除叶片活性氧，增强抗光氧化能力[17-18]；在高光强下，转PEPC基因水稻光化学效率下降较少，光化学猝灭系数较为恒定，表现出耐光抑制[19-20]。在其他逆境或外源物质处理下，转PEPC基因水稻也表现出与对照不一样的生理特性。在低氮情况下，转PEPC基因水稻表现出耐低氮的优势，碳氮关键酶活性较高，参与光呼吸相关基因表达上调，并具更高的单株产量[21-22]。干旱胁迫下，转PEPC基因水稻的光合及抗氧化系统能保持相对较高的稳定性，可减轻干旱胁迫对光合作用的抑制作用，具较强的抗旱能力[23-24]；且其抗旱性与糖类代谢及Ca2+、NO、H2O2相关的信号传递有关[25-27]。外源草酰乙酸、苹果酸及亚硫酸氢钠处理可以增强转玉米PEPC水稻的光合速率[28-29]。因此，转C4-PEPC水稻的生理特性发生了明显的变化。同时，研究者将转C4-PEPC水稻进一步应用于育种，发现C4-PEPC在新遗传背景下能高水平表达并稳定遗传，杂交后代的光合特性得到了一定改善，被认为值得进一步考察和利用[30-32]。另外，C4-PEPC的转入会影响水稻籽粒中的组成成分含量。李霞等[33]的研究表明，转PEPC水稻籽粒中可溶性糖和蛋白质含量显著增加，而淀粉含量无明显变化；张边江等[34]研究表明，转PEPC水稻籽粒中脂肪质量分数显著增加，可溶性糖质量分数降低，而水分、灰分和淀粉的质量分数无显著差异。

综上所述，现有的相关绝大部分研究侧重于C4-PEPC水稻的生理生化方面，包括光合特性和抗逆特性等，而关于C4-PEPC对稻米影响的研究较少。本研究拟分析转C4-PEPC水稻的粒形、稻米淀粉粒分布情况、稻米品质和稻米成分，以期为完善C4-PEPC在C3植物水稻中的功能分析提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

航2号对照(CK)水稻及不同株系的高代转C4-PEPC水稻种子，均由福建省农业科学院水稻研究所农业农村部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室保存。当年收获，室温放置3个月后用于后续试验。

1.2 试验方法

1.2.1 粒形分析 采用万深SC-G型自动考种及千粒重分析仪对航2号水稻和转C4-PEPC水稻种子的粒形进行分析，测定谷粒的周长、长、宽、直径、面积和千粒质量。每个样品重复测定5次，每个重复150粒。

1.2.2 电镜扫描观察 将航2号及转C4-PEPC株系稻谷送往福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，电镜扫描观察其横截面及淀粉粒分布情况。据观察，不同转基因株系情况类似，因此随机选择其中1个株系进行拍摄。

1.2.3 米质的测定 收获成熟种子自然晒干，室温放置3个月。每个品种称取200 g，采用中华人民共和国农业农村部标准米质测定方法(NY/T 83-2017)对样品的米质进行测定，每个样品重复测3次，计算其垩白率和垩白度。其中，垩白率是具垩白的稻米数量占稻米总数的比率，垩白度是测定稻米中垩白部位的面积占米粒投影面积的比例。

1.2.4 稻米总碳和糖类含量的测定 随机选择其中1个转C4-PEPC水稻株系进行后续的物质含量测定。样品送福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所测定稻米总碳含量；样品处理以及可溶性总糖和蔗糖含量的测定参见《植物生理学实验指导》[35]；样品送往苏州科铭生物技术有限公司测定支链淀粉含量。每个样品重复测定 3 次。

1.2.5 稻米总氮和氨基酸含量的测定 采用凯氏定氮法测定稻米的总氮含量；采用高效液相色谱法(HPLC，Agilent 1100)测定稻米17种氨基酸含量。每个样品重复测3次。

1.3 数据处理

试验数据采用单因素方差分析或t-检验分析，以P≤0.05为差异显著；采用 SPSS 软件及Microsoft Excel 2019进行统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 转C4-PEPC水稻的粒形分析

谷粒粒形分析结果(表1)显示，与对照相比，转C4-PEPC水稻3个株系(tPEPC1、tPEPC2、tPEPC3)的谷粒周长均较对照减小7.82%～9.27%，谷粒长较对照减小8.00%～10.33%，谷粒宽较对照减小8.31%～8.92%，且均差异显著。转C4-PEPC水稻株系的谷粒直径和谷粒面积也相对较小，但只有tPEPC3株系与对照差异显著。

表1 转C4-PEPC水稻稻谷的粒形分析Table 1 Grain shape of rice with C4-PEPC

另外，转C4-PEPC水稻3个株系的千粒质量均明显小于对照，较对照降低8.96%～11.74%，其中tPEPC1和tPEPC2株系与对照差异极显著，tPEPC3株系与对照差异显著。与对照相比，转C4-PEPC水稻的谷粒长较短，去除颖壳后转C4-PEPC水稻的稻米也较短(图1)。上述结果表明，外源C4-PEPC的导入明显改变了水稻稻谷的粒形。

2.2 转C4-PEPC水稻稻谷横截面的电镜扫描观察

为了探明C4-PEPC的导入是否会影响稻米的内部结构，采用电镜扫描观察稻谷横截面，结果见图2。

图2显示，转C4-PEPC水稻(tPEPC)的淀粉结构与对照有明显差别，tPEPC稻米的淀粉粒排列明显较为松散，而对照淀粉粒排列紧密。表明转C4-PEPC稻米的内部结构发生了明显变化，即外源C4-PEPC的导入对稻米内部结构产生了明显影响。

2.3 C4-PEPC水稻稻米品质分析

由表2可以看出，与对照相比，转C4-PEPC株系稻米的直链淀粉含量均有所降低，其中tPEPC2和tPEPC3株系降低显著。转C4-PEPC株系稻米的胶稠度和碱消值与对照无明显差别。转C4-PEPC株系tPEPC1和tPEPC3稻米的垩白率较对照显著降低，而tPEPC2的垩白率较对照降低不显著。tPEPC1、tPEPC2、 tPEPC3株系的垩白度较对照均有所降低，但差异均不显著。该结果表明，外源C4-PEPC的导入对稻米品质产生了一定影响，其中对直链淀粉含量和垩白率的影响较为明显。

表2 转C4-PEPC水稻稻米品质的分析Table 2 Grain quality analysis of rice with C4-PEPC

2.4 转C4-PEPC稻米的总碳和糖类含量

稻米的主要成分是糖类，因此对稻米中的总碳、可溶性糖、蔗糖和支链淀粉含量进行了测定，结果见表3。由表3可以看出，转C4-PEPC水稻(tPEPC)稻米的总碳含量相对较高，但与对照无显著差异。转C4-PEPC稻米的支链淀粉含量较对照提高7.00%，差异显著；蔗糖含量较对照降低24.16%，差异极显著；可溶性糖含量较对照降低31.06%，差异极显著。表明外源C4-PEPC的导入影响了稻米中不同糖类含量的分配。

表3 转C4-PEPC稻米总碳和糖类含量的测定Table 3 Determination of total carbon and sugar contents in grain of rice with C4-PEPC mg/g

2.5 转C4-PEPC稻米的总氮及氨基酸含量

稻米成分除主要的糖类外还含有少量的蛋白质，进一步测定了稻米中的总氮含量和17种氨基酸含量，结果见表4。

表4 转C4-PEPC稻米总氮及氨基酸含量的测定结果Table 4 Determination result of total nitrogen and amino acids contents in grain of rice with C4-PEPC

由表4可以看出，转C4-PEPC(tPEPC)稻米的总氮含量明显较低，较对照降低8.77%。与对照相比，转C4-PEPC稻米中的天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等14种氨基酸的含量均明显较低，且差异达显著或极显著水平；而脯氨酸、异亮氨酸、色氨酸3种氨基酸的含量与对照无明显差别。表明外源C4-PEPC的导入对稻米的各种氨基酸含量产生了一定影响。

3 讨 论

PEPC在高等植物的初级代谢中起着重要作用，在调节碳氮耦合代谢中也扮演着重要角色[36]。本研究结果表明，与对照相比，转C4-PEPC水稻谷粒较短较窄，并且去掉颖壳后稻米也较短较窄，说明谷粒较小与稻米较小有关。同时，转C4-PEPC水稻的千粒质量明显较轻，这可能与转C4-PEPC水稻的谷粒较小有关。电镜扫描结果显示，转C4-PEPC水稻稻米淀粉粒的排列较为松散，说明其灌浆不够充分。

外源PEPC的导入对受体植物种子成分会产生一定程度影响。Rolletschek等[37]研究发现，导入外源PEPC的转基因豌豆种子中，粗蛋白和游离氨基酸含量增加，而蔗糖和磷酸化糖类含量减小。本研究结果表明，转C4-PEPC水稻株系稻米中的直链淀粉含量明显降低，稻米品质发生了一定的改变。与李霞等[33]和张边江等[34]转PEPC水稻籽粒的淀粉含量无显著变化的结果并不一致，其可能的原因有两个方面：一方面是所导入的PEPC来源不同，之前研究导入的是来自玉米的PEPC，而本研究导入的是甘蔗PEPC，不同来源的PEPC可能在活性和功能方面存在一些差异；另一方面是受体所属亚种不同，之前的研究受体是粳稻Kitaake，而本研究的受体是籼稻航2号。本研究结果表明，转C4-PEPC稻米的总碳含量相对较高，且支链淀粉含量明显高于对照，而蔗糖和可溶性糖含量较低，这可能是由于C4-PEPC的导入影响了稻米中各糖分的分配，与张边江等[34]报道的转PEPC水稻籽粒中可溶性糖质量分数降低的结果一致。另外，本研究结果显示，转C4-PEPC稻米中的总氮含量及大部分氨基酸含量均有所较低。Lian等[38]的研究却表明，转C4-PEPC水稻植株中的总碳及总氮含量较对照显著增加，而其稻米中的总碳含量与对照无显著差别，总氮含量显著降低。这可能是因为营养物质从源到库是一个复杂的生理生化过程，且受许多因素的影响，源和库中的物质含量水平并不一定完全一致。关于外源C4-PEPC在水稻中是如何影响稻米各成分的含量及各成分的分配，以及其相关的作用机制等还有待于进一步研究。

4 结 论

导入外源C4-PEPC籼稻的谷粒较小，内部淀粉粒排列比较松散，直链淀粉含量和垩白率明显降低，蔗糖及可溶性糖含量极显著降低，而支链淀粉含量显著增加，总氮及大部分氨基酸含量降低显著。本研究结果表明，C4-PEPC对水稻粒形、稻米品质和成分产生了明显的影响，初步反映了C4-PEPC在水稻中的功能，为该基因应用于C3植物提供了一定的理论依据。