荷载甘草酸EL100-55/PLGA肠溶纳米粒的制备及其对葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎的治疗作用

田春雨，秦之琦，汤洪萍，郝吉福

荷载甘草酸EL100-55/PLGA肠溶纳米粒的制备及其对葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎的治疗作用

田春雨，秦之琦#，汤洪萍，郝吉福*

山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，山东 泰安 271016

制备荷载甘草酸Eudragit L100-55/聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物肠溶纳米粒［glycyrrhizic acid loaded Eudragit L100-55/poly(lactic-co-glycolic acid)enteric nanoparticles，GA@EL100-55/PLGA NPs］，并考察其对葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）诱导结肠炎模型小鼠的治疗作用。采用复乳化溶剂蒸发法制备GA@EL100-55/PLGA NPs，并对其形貌、粒径大小、表面ζ电位等理化性质进行表征；以体质量及结肠长度变化为指标，考察其对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的治疗效果。以细胞膜红色荧光染料1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine,4-chlorobenzenesulfonate salt（DiD）为探针，探讨纳米粒在肠道的滞留情况。GA@EL100-55/PLGA NPs外观呈圆球状，平均粒径为（166.0±3.4）nm，ζ电位为（−7.17±0.22）mV；包封率及载药量分别为（91.51±0.26）%和（5.35±0.01）%。体外释放结果提示，GA@EL100-55/PLGA NPs具有pH值响应特性及缓释效果。药效学实验证明GA@EL100-55/PLGA NPs能够对DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠具有保护作用。GA@EL100-55/PLGA NPs为甘草酸在治疗溃疡性结肠炎提供新的递送形式。

甘草酸；聚合物Eudragitl100-55；聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物；纳米粒；溃疡性结肠炎；葡聚糖硫酸钠；复乳化溶剂蒸发法

炎症性肠病（inflammatory bowel diseases，IBD）为限定在回肠和结肠粘膜部位的慢性炎症疾病，根据炎症的发生位置和进展模式可分为克罗恩病（Crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）2种类型，患者会出现腹痛、腹泻及血便等症状，甚至会恶变成直肠癌[1-2]。目前通常采用抗炎、免疫调节剂、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抑制剂及抗生素等治疗UC[3]，但存在较严重的不良反应和免疫原性，且复发率较高。甘草酸为甘草中的主要活性成分，具有抗炎镇痛、抗溃疡、抗氧化等作用[4-5]。然而口服递送甘草酸受肝脏首过效应及肠道黏膜的代谢会降低其疗效[6-8]。如何将甘草酸有效递送到炎症肠道部位，成为利用甘草酸治疗UC亟待解决的关键问题。

聚合物Eudragit L100-55（EL100-55）为聚丙烯酸类肠溶材料，呈典型的pH值相关性，能够响应胃肠道生理环境，在较高的pH值下降解，调控药物在肠道释放。聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物［poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA］作为生物可降解材料，具有缓释作用[9]。两者被广泛用作药物递送系统的载体材料[10-12]。纳米制剂可增加所包载药物的稳定性和溶解度，促进跨膜转运，提高其安全性和有效性。有研究证明纳米制剂在小鼠结肠炎模型中具有结肠部位聚集的特性[13-15]。因此，利用EL100-55及PLGA 2种材料制备荷载甘草酸的肠溶纳米颗粒，可实现药物在肠道的定位及控释释放，增强甘草酸对肠道炎症组织的渗透性和滞留性，实现对炎症性肠病的治疗。

本课题拟以甘草酸为模型药物，EL100-55及PLGA分别作为肠溶材料及缓释载体材料，采用复乳化溶剂蒸发法制备荷载甘草酸的肠溶纳米粒［glycyrrhizic acid loaded Eudragitl100-55/poly(lactic- co-glycolic acid) enteric nanoparticles，GA@EL100- 55/PLGA NPs］，并对其进行理化性质表征。ig给药后评价GA@EL100-55/PLGA NPs对DSS诱导小鼠UC模型的治疗作用，以期为甘草酸治疗UC提供新的递送形式。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BT25S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；EYELA FDU-1200型冷冻干燥机，日本东京理化株式会社；85-2型恒温磁力搅拌器，金坛市城东新瑞仪器厂；UV-8000A型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；Zetasizer型纳米粒度和电位仪，英国马尔文公司；IRAffini型傅里叶变换红外光谱仪，日本岛津株式会社制作所；JEM1200EX型透射电子显微镜（TEM），日本JEOL公司；JY92- 2D型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Master型多区荧光成像光谱仪，武汉光映美科技有限公司。

1.2 药品与试剂

PLGA，乳酸和羟基乙酸的质量比为75∶25，相对分子质量15 000～23 000，批号20200625，购自济南岱罡生物工程有限公司；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA，相对分子质量为30 000～40 000，批号BCBG8296V，购自默克Sigma-Aldrich公司；甘草酸，批号E1909076，相对分子质量822.93，购自上海阿拉丁试剂有限公司；透析袋，相对分子质量8000～14 000，批号408D023，购自北京索莱宝科技有限公司；EL100-55，批号B111204040，购自Evonik Industries AG公司；细胞膜红色荧光染料1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetra-methylindo dicarbocy- anine,4-chloroben zenesulfonate salt（DiD），批号10048，购自上海睿铂赛生物科技有限公司；葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS），相对分子质量40 000，批号20210126，购自美伦生物技术有限公司。

1.3 动物

雄性SPF级健康昆明小鼠，体质量（22±5）g，由山东省实验动物中心提供，实验动物许可证号SYXK（鲁）20120005。动物实验经山东第一医科大学实验动物临床委员会批准，审查编号W202203040129。

2 方法与结果

2.1 GA@EL100-55/PLGA NPs的制备

采用复乳化溶剂蒸发法制备GA@EL100-55/ PLGA NPs[16-17]。将50.0 mg EL100-55及100.0 mg PLGA溶于无水乙醇和醋酸乙酯（体积比为1∶3）的混合溶剂中，作为有机相；将10.0 mg甘草酸溶于1.0 mL蒸馏水中，调节pH值至2.7，作为水相，在冰浴条件下，将2相混合置于探头超声仪中，超声2 min（功率400 W），形成W/O型乳剂。随后将该W/O型乳剂分散到10.0 mL含有0.5% PVA的水溶液（pH 4）中，继续超声3 min（功率400 W），形成W/O/W型复乳，置于磁力搅拌器上搅拌除去有机溶剂。随后采用12 000 r/min超速离心15 min去除游离药物，将沉淀用蒸馏水洗涤2次，即得GA@EL100-55/PLGA NPs，经冷冻干燥后备用。荷载甘草酸的PLGA纳米粒（GA@PLGA NPs）及荧光探针DiD的PLGA纳米粒（DiD@PLGA NPs）制备方法同上。所制备的纳米粒呈乳白色，略带淡蓝色乳光，具有明显的丁达尔效应，外观如图1所示。

图1 GA@EL100-55/PLGA NPs (A) 和GA@PLGA NPs (B) 的外观特征

2.2 GA@EL100-55/PLGA NPs理化性质表征

2.2.1 粒径、ζ电位及形貌观察 所制备纳米粒的粒径、ζ电位结果见图2。GA@EL100-55/PLGA NPs、GA@PLGA NPs的粒径分别为（166.0±3.4）、（144.1±2.8）nm，多分散指数（polydispersity index，PDI）分别为0.21±0.01、0.12±0.03。表明粒径大小均匀，呈正态分布，分散性良好。GA@ EL100-55/ PLGA NPs的ζ电位（−7.17±0.22）mV低于GA@ PLGA NPs（−6.15±0.22）mV，这与EL100-55带有较多的负电荷，从而降低纳米粒的ζ电位有关。

图2 GA@PLGA NPs (A) 和GA@EL100-55/PLGA NPs (B)的粒径分布(I)和ζ电位(II)

另将所制备的纳米粒滴于覆盖有碳膜的铜网上，经2%磷钨钼酸负染后采用TEM观察形貌，结果见图3。所制备的纳米粒外观呈圆整、规则的球状结构，表面无粘连。

图3 GA@PLGA NPs (A)和GA@EL100-55/PLGA NPs (B)的形貌

2.2.2 溶解性能评价 根据EL100-55及PLGA在不同溶剂中溶解性能，探讨2种载体材料在纳米颗粒表面的分布情况。取5.0 mg所制备的GA@ EL100-55/PLGA NPs和GA@PLGA NPs冻干粉，分别加入到无水乙醇和醋酸乙酯中，涡旋混匀后观察在不同溶剂中的溶解情况。

结果表明GA@EL100-55/PLGA NPs冻干粉在无水乙醇部分溶解，呈现浑浊状态，在醋酸乙酯中不能溶解，溶液呈无色透明，纳米粒沉降在底部；而GA@PLGA NPs的溶解性则相反，在无水乙醇中不溶，在醋酸乙酯中全部溶解。这与EL100-55能够溶于无水乙醇而不溶于醋酸乙酯，PLGA溶于醋酸乙酯而不溶于无水乙醇有关，表明纳米粒的表面存在EL100-55，能够赋予纳米粒肠溶性能。

2.2.3 包封率及载药量的测定 采用超速离心法测定纳米粒的包封率及载药量[18-19]。分别精密量取2.0 mL GA@EL100-55/PLGA NPs及GA@PLGA NPs混悬液，各加入0.3 g硫酸铵沉淀纳米粒，10 000 r/min离心（离心半径5 cm）15 min，于252 nm处测定上清液的吸光度（）值，根据标准曲线方程＝12.792－0.005 4（2＝0.999 6）计算甘草酸质量，作为未被包封的游离药物量（1）；制备纳米粒时甘草酸的总投药量为0，t为GA@EL100-55/ PLGA NPs或GA@PLGA NPs的总质量。根据下列公式计算包封率和载药量，结果见表1。

包封率＝(0－1)/0

表1 包封率和载药量测定结果(, n = 3)

载药量＝(0－1)/t

与GA@PLGA NPs相比较，GA@EL100-55/ PLGA NPs具有较高的包封率，与其制备过程中调节pH值有关。通过调节内水相pH值至2.7，可抑制甘草酸解离，使其以分子形式包载到聚合物材料中，并防止药物泄漏到外水相中；调节外水相pH值至4可防止EL100-55因pH值过高而发生解离。

2.2.4 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析 精密称取2.0 mg甘草酸、PLGA、EL100-55及GA@EL100-55/PLGA NPs冻干品，与20 mg KBr研磨混匀后压片，在400～4000 cm−1进行FTIR扫描，结果见图4。可知，甘草酸的O-H键伸缩振动在3401 cm−1附近存在较宽的伸缩振动峰，在2947、2855 cm−1处为-CH2不对称伸缩振动峰，1730、1646 cm−1为C＝O的伸缩振动峰，1459 cm−1为-CH2的弯曲振动峰，O-H平面弯曲在1279、1032 cm−1为仲环醇C-O的特征吸收峰，C-C峰在979、700 cm−1处，N-H弯曲振动在615 cm−1处。PLGA的FTIR图谱在3517 cm−1处为羟基中O-H键伸缩振动峰，2926、2855 cm−1处为C-CH2振动峰，1746、1629 cm−1处为C＝O峰，C-OH面内弯曲在1427 cm−1。EL100-55聚合物在1357、1427 cm−1处有C-H振动峰。GA@EL100-55/ PLGA NPs的FTIR图谱显示，在3383 cm−1处O-H吸收峰变宽，在1037 cm−1处显示仲环醇C-O的伸缩振动峰，2者为甘草酸的特征峰。同时在1300～1400 cm−1处出现EL100-55的特征峰以及PLGA与EL100-55的叠加峰。提示药物与聚合物之间良好的相容性，能够被包载到聚合物中形成骨架型纳米粒。

图4 甘草酸(A)、PLGA (B)、EL100-55 (C) 及GA@ EL100-55/PLGA NPs (D) 的FTIR图谱

2.2.5 体外释药性能研究 采用透析法考察所制备纳米粒的体外释放行为，以评价其是否具有pH值响应性的释放特征[20]。精密量取GA@EL100-55/ PLGA NPs和GA@PLGA NPs混悬液各2.0 mL，封装于预处理好的透析袋中，先将其浸入50 mL人工胃液（pH值为1.2）中，并置于37 ℃恒温空气振荡浴内，调节振荡频率为100 r/min，在0～2 h时间间隔内，分别于0.5、1.0、2.0 h吸取释放介质2.0 mL，在2.0 h后取出透析袋并用蒸馏水冲洗2次以除去残留的人工胃液。随后将透析袋转移到50 mL人工肠液中（pH值为7.4），分别于4、6、24、48、72 h取样2.0 mL，每次取样后补加等量的释放介质。于252 nm处测定各时间点释放介质中甘草酸的值根据下列公式计算甘草酸的体外累积释放率（Q）。

Q为药物不同时刻的累积释放率，0为释放介质的总体积，为取样次数，C为第次取样时测得的药物质量浓度，为每次取样体积，为投入药物总质量

体外药物释放结果如图5所示，当释放介质为pH 1.2的人工胃液时，在0～2 h内，GA@EL100- 55/PLGA NPs 2 h累积释放率仅为3.71%，而GA@ PLGA NPs的累积释放率可达到17.80%，这与GA@ EL100-55/PLGA NPs表面存在着肠溶材料有关，在酸性环境下不降解而阻滞药物释放。当释放介质替换为pH值7.4人工肠液时，GA@EL100-55/PLGA NPs的累积释放率呈持续增加趋势，这与肠溶材料溶解导致药物释放有关，表现出与pH值相关的释放特征。

图5 GA@EL100-55/PLGA NPs和GA@PLGA NPs体外释放特性(, n = 3)

2.3 GA@EL100-55/PLGA NPs对DSS诱导UC的治疗作用

2.3.1 实验动物分组及模型的建立 将实验小鼠随机分为5组，每组6只，即对照组、DSS模型组、甘草酸组、GA@PLGA NPs组和GA@EL100/PLGA NPs组，适应喂养1周后进行实验。除对照组给予蒸馏水外，其他各实验组连续7 d自由饮用4% DSS溶液，以建立小鼠UC模型。从第8天开始撤去4% DSS溶液，更换为蒸馏水，随后甘草酸组、GA@ PLGA NPs组和GA@EL100/PLGA NPs组按照10 mg/kg的剂量每日ig给药1次，DSS模型组按照等剂量每日ig蒸馏水1次，连续7 d。

2.3.2 小鼠日常状况观察 实验进行期间，观察各实验组小鼠的活动情况、精神状态、饮食饮水情况、体质量变化、粪便状态及是否有便血等异常情况。将每只小鼠体质量与其初始时的体质量进行比较，记录各组小鼠每日体质量变化率。如图6所示，从各组小鼠体质量变化情况可见，对照组小鼠在整个实验过程中体质量呈增加趋势。在建模过程中，各实验组之间体质量没有组间差异。实验结束时，与对照组相比，DSS模型组体质量显著减轻（＜0.05），并出现稀溏便。在治疗过程中，与DSS模型组比较，甘草酸组、GA@PLGA NPs组和GA@ EL100/PLGA NPs组小鼠体质量均有所增加，其中经GA@EL100-55/PLGA NPs治疗后小鼠体质量显著增加，表现出较好的治疗效果（＜0.05）。

与对照组比较：*P＜0.05；与DSS模型组比较：#P＜0.05

2.3.3 组织标本的收集及评估 药物干预结束后，将各组小鼠脱颈椎处死，剪开腹腔，分取胃至肠道末端的组织，测量从回盲部到肛门边缘的结肠长度并称定质量，以结肠长度及结肠质量与长度比的变化作为炎症评价的指标。由于脾脏作为炎症调节的重要器官，其质量变化也可作为衡量炎症程度的指标。取各组小鼠脾脏并称定质量，以脾脏质量/体质量计算脾脏系数[21-22]。脾脏质量变化结果见表2，与对照组比较，DSS模型组小鼠脾脏质量明显增加（＜0.01）；与DSS模型组比较，各给药组脾脏质量均有所减小，相对于GA@PLGA NPs组和甘草酸组，GA@EL100-55/PLGA NPs组的脾脏质量减小的更明显，且与DSS模型组的差异具有统计学意义（＜0.05）。与对照组相比，DSS模型组的脾脏系数明显增加（＜0.05），提示DSS能够诱导炎症；与DSS模型组比较，各给药组脾脏系数均有所减小，相对于GA@PLGA NPs组和甘草酸组，GA@ EL100-55/ PLGA NPs组的脾脏系数减小的更明显，且与DSS模型组的差异具有统计学意义（＜0.05），这表明其对结肠炎症具有较好的免疫调节作用，有效地降低结肠炎症程度。

小鼠结肠长度变化情况见表3。与对照组相比，DSS模型组小鼠结肠长度明显缩短（＜0.01）。与DSS模型组相比，给予GA@EL100-55/PLGA NPs治疗后结肠变化具有统计学差异（＜0.05），不论结肠长度还是结肠质量/长度都更接近于对照组，表明给予GA@EL100-55/PLGA NPs能有效减轻结肠炎症的程度。

表2 小鼠脾脏变化(, n = 3)

与对照组比较：*＜0.05**＜0.01；与DSS模型组比较：#＜0.05，下表同

*< 0.05**< 0.01control group;#< 0.05DSS model group, same as below tables

表3 小鼠结肠变化(, n = 3)

2.4 GA@EL100-55/PLGA NPs胃肠道的滞留

为示踪口服给药后纳米粒在胃肠道的行为，以DiD为荧光探针，制备DiD@EL100-55/PLGA和DiD@PLGA NPs[23]。小鼠ig给予荷载荧光探针的纳米粒后，分别于给药0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h处死，分取胃至肠道末端部分，采用荧光成像仪观察纳米粒在小鼠胃肠道不同位置的滞留情况（激发波长644 nm/发射波长664 nm），以评估纳米粒在消化道内的分布，结果见图7。由图7可知，随时间推移，荧光探针会从胃部向肠道转运。DiD@PLGA NPs在胃部显示出较强的荧光，这与DiD@PLGA在胃中降解导致荧光探针DiD释放有关。在0～2 h内，DiD@EL100-55/PLGA NPs在胃部的荧光强度较弱，表明其在胃部不发生降解，而在4 h时结肠部位显现较强荧光信号，表明DiD@EL100-55/ PLGA NPs能够在结肠部位定位释放。

图7 小鼠胃肠道部位荧光成像

上述结果证实了DiD@EL100-55/PLGA NPs能够避免药物在胃部的降解，通过响应pH值的变化到达肠道释放药物，实现定位释放的目的。

3 讨论

甘草酸具有黏膜保护、抗氧化和抗炎等作用[24]，然而口服递送甘草酸胃肠道pH值、首过效应及在肠道代谢的影响，常规制剂难以有效地将甘草酸递送药物到炎症结肠部位，无法达成对UC的有效治疗，如何将甘草酸递送到炎症肠道部位并防止其代谢成为亟待解决的关键问题。因此，实现靶向定位给药，成为治疗UC的关键策略。本实验通过复乳化溶剂蒸发法构建GA@EL100-55/PLGA NPs，利用纳米制剂的纳米尺度效应能够促进纳米粒在炎症结肠部位聚集性及渗透性；同时，借助于EL100及PLGA分别作为肠溶材料及缓释材料，可减少药物在胃部的释放，使更多药物到达结肠部位，并借助PLGA实现缓释效果，进而提高疗效。

溶解性实验和红外光谱分析证明，GA@EL100- 55/PLGA NPs表面存在EL100，且药物与聚合物之间具有良好的相容性，能够被包载到聚合物中形成骨架型纳米粒。在模拟胃肠道pH值环境的体外药物释放结果表明，GA@EL100-55/PLGA NPs能有效减少在胃部环境（pH 1.2）的药物突释，并在结肠环境（pH 7.4）下持续释放药物直至完全。采用小动物成像实验证明了GA@EL100-55/PLGA NPs结肠靶向的趋势，提示GA@EL100-55/PLGA NPs能够在结肠部位聚集，并达到药物缓释作用。药效学实验结果表明，GA@EL100-55/PLGA NPs能够对DSS诱导的结肠炎模型小鼠产生保护作用，结肠长度、脾脏指数等结果显示出良好的抗炎作用。

综上所述，GA@EL100-55/PLGA NPs可以根据结肠pH值环境实现结肠定位释放药物，其缓释作用可使药物延长治疗结肠黏膜炎症的时间，因而，利用2种不同性质的聚合物材料制备成纳米粒，可以赋予纳米粒具有缓释与定位的双重功能，能够为结肠炎症疾病的治疗提供了新的递送方式。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Preparation of glycyrrhizic acid-loaded EL100-55/PLGA enteric nanoparticles and evaluation of their effect on dextran sodium sulfate induced ulcerative colitis

TIAN Chun-yu, QIN Zhi-qi, TANG Hong-ping, HAO Ji-fu

School of Pharmacy, Shandong First Medical University (Shandong Academy of Medical Sciences), Taian 271016, China

To prepare glycyrrhizic acid loaded Eudragit L100-55/poly(lactic-co-glycolic acid) enteric nanoparticles, GA@EL100-55/PLGA NPs, and evaluate their effect on dextran sodium sulfate (DSS) induced ulcerative colitis.GA@EL100-55/PLGA NPs were prepared by double-emulsion and solvent-evaporation method, and their physicochemical properties, such as morphology, particle size distribution as well as ζ potential, were characterized; In light of the changes of body weight and colon length, the therapeutic effect on ulcerative colitis induced by DSS in mice was investigated. The retention of GA@ EL100-55/PLGA NPs in the gastrointestinal tract was determined using 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine,4- chlorobenzenesulfonate salt (DiD) as fluorescent probe.The morphology of GA@EL100-55/PLGA NPs were spherical with the average particle size of (166.0 ± 3.4) nm and ζ potential of (−7.17 ± 0.22) mV. The encapsulation efficiency and drug loadings were (91.51 ± 0.26)% and (5.35 ± 0.01)%, respectively. Thedrug release of GA@EL100-55/PLGA NPs showed pH-responsive and sustained release properties. In addition, pharmacodynamics experiments demonstrated that GA@EL100-55/ PLGA NPs had better protection on DSS induced colitis model mice.GA@EL100-55/PLGA NPs can provide a novel delivery system of glycyrrhizic acid for treatment of ulcerative colitis disease.

glycyrrhizic acid; Eudragit L100-55; poly(lactic-co-glycolic acid); nanoparticles; ulcerative colitis; dextran sodium sulfate; double-emulsion and solvent-evaporation method

R283.6

A

0253 - 2670(2022)21 - 6734 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.010

2022-05-22

山东第一医科大学2021年山东省大学生创新创业训练计划项目（S202110439008）

田春雨（1998—），女，硕士研究生，从事药物新剂型与新技术研究。E-mail: 568508277@qq.com

郝吉福（1976—），男，教授，从事药剂学教学及药物新剂型研究与开发。E-mail: haojifu@163.com

#共同第一作者：秦之琦（2001—），男，本科生，从事药物新剂型的研究。E-mail: 1025889216@qq.com

[责任编辑 郑礼胜]