基于GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技术的首荟通便胶囊质量标志物研究

梁红宝，孙建之，姜宇珺，袁晓梅，姚景春，关永霞，张贵民，李 峰

基于GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技术的首荟通便胶囊质量标志物研究

梁红宝1, 2, 3，孙建之2, 3，姜宇珺2, 3，袁晓梅2，姚景春2, 3，关永霞2，张贵民1, 2, 3，李 峰1*

1. 山东中医药大学，山东 济南 250355 2. 鲁南制药集团股份有限公司 中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006 3. 山东新时代药业有限公司，山东 临沂 276006

对首荟通便胶囊化学成分及其裂解规律进行系统分析，并探索其治疗便秘的潜在质量标志物（quality marker，Q-Marker）。采用GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技术对首荟通便胶囊中化学成分进行定性分析，并根据Q-Marker判定的“五原则”，对其潜在的Q-Marker进行研究。通过GC-MS数据库匹配，从挥发油中共鉴定出7个化合物，包括炔醇类1个和6个脂肪酸类。通过质谱信息并结合对照品、相关文献、数据库检索，LC-MS共鉴别出了60个化合物，包括蒽醌类10个、蒽醌苷类5个、糖苷类12个、黄酮类11个、黄酮苷类4个、皂苷类4个、香豆素类2个、萘并吡喃酮类1个、内酯类2个、蒽酮苷类2个、脂肪酸类1个、有机酸类1个、倍半萜类1个、多酚类1个和其他类化合物3个。结合有效、特有、传递与溯源、可测和处方配伍的原则，预测出2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2β葡萄糖苷、芦荟大黄素、橙黄决明素、槲皮素、-羟脯氨酸、人参皂苷、苍术酮和柚皮素等8种成分可能为首荟通便胶囊的Q-Marker。建立了首荟通便胶囊的GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS的分离鉴定方法，并预测了首荟通便胶囊的Q-Marker，为阐释该复方的功效物质基础及质量标准提升提供了依据。

GC-MS；UPLC-Q Exactive MS；首荟通便胶囊；裂解规律；质量标志物；2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2β葡萄糖苷；芦荟大黄素；橙黄决明素；槲皮素；-羟脯氨酸；人参皂苷；苍术酮；柚皮素

首荟通便胶囊为2015年经国家药监局批准的中药创新药，在临床上用于功能型便秘，中医辨证属气阴两虚兼毒邪内蕴证。全方以何首乌、芦荟、决明子、枸杞子、阿胶、人参、白术、枳实8种药材配伍而成，其中人参味甘、微苦，性微温，有大补元气、益智安神、生津止渴的功效，本方取其生津以润肠、大补元气以助大肠推进之功。芦荟长于清肝、通便，二药配伍，可益气生津、泻下热结，共为君药。何首乌因其味苦能泻，养血滋阴、润肠通便，可治血虚津亏之肠燥便秘。阿胶作为滋阴补血要药，配伍人参增其滋阴润燥之效，配伍首乌以助养血润肠之功，二药共为臣药。决明子味微苦微甘，有清肝明目、润肠通便之功，可助芦荟、首乌泻热通便。枸杞子具有滋补肝肾、益精明目、滋阴养血之功效。《本草汇言》称枸杞“润肺生津，补肾添精”，可助首乌、阿胶益精补血润肠。白术苦甘性温，益气健脾，枳实苦辛酸微寒，可破气消积、化痰散疮。概而方之，枳实、决明子助君、臣药泻热行滞通便，枸杞子、白术助君、臣药补气滋阴润肠，俱为佐药。同时枳实兼为使药，引药入经，可引方中诸药直达大肠腑[1]。诸药配伍，攻下之力缓，扶正之效著，符合“补气行舟、增水行舟”理论，治疗气阴不足，燥热内结之便秘，是通便排毒、减肥调脂的国家专利组方[2-3]。

首荟通便胶囊化学成分及质量控制的研究报道不多。其中，彭艳等[4]采用HPLC-MS/MS 法同时对首荟通便胶囊中8种成分进行分析；马云等[5]建立了测定首荟通便胶囊中2,3,5,4-四羟基二苯乙烯- 2β葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚等7种成分的HPLC方法。这些报道，为首荟通便胶囊的质量控制水平的提高提供了新方法，但这些指标成分不一定是效应成分，不能真正反映全方的质量。中药质量标志物（quality marker，Q-Marker）概念的提出，为中药质量控制提供了新的思路和方法。为了完善首荟通便胶囊的质量标准，本研究利用GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技术对首荟通便胶囊中的化学成分进行定性分析，并基于鉴定的成分，结合Q-Marker判定的五原则，预测首荟通便胶囊的潜在Q-Marker。

1 材料与仪器

Thermo scientific trace 1310 ISQ/LT气相色谱-质谱联用仪（赛默飞世尔科技公司，美国），UPLC-Q-Exactive MS四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱（赛默飞世尔科技公司，美国），Thermo TR-V1色谱柱（30 m×0.25 mm，1.4 μm，赛默飞世尔科技公司，美国），Waters ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，沃特世科技有限公司，美国），万分之一天平和十万分之一天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），GTSONIC-P13型超声波清洗器（江苏苏州江东精密仪器有限公司），挥发油提取装置，电子调温电热套（河南豫华仪器有限公司）。对照品二苯乙烯苷（19COX0141-SL-OL，质量分数≥98.6%）、大黄素（110756-201913，质量分数≥99.2%）和大黄酚（110796-201922，质量分数≥99.6%）购自标准药物（中国）有限公司；新橙皮苷（111857-201804，质量分数≥99.4%）、橙皮苷（110721-202019，质量分数≥95.3%）、芦荟苷（110787-202109，质量分数≥94.8%）、芦荟大黄素（110795-201710，质量分数≥97.5%）、柚皮苷（110722-202116，质量分数≥93.5%）、木犀草素（111520-201605，质量分数≥96.3%）购自中国食品药品检定研究院。首荟通便胶囊（批号26220211），由鲁南厚普制药有限公司提供。乙腈（质谱级，德国Merck KGaA公司），无水甲酸（分析纯，西陇科学股份有限公司），甲酸[质谱级，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 GC-MS供试品的制备 按照《中国药典》2020年版挥发油测定法（通则2204甲法）提取挥发油，称取首荟通便胶囊内容物100 g，置圆底烧瓶中，加10倍量水，加热回流提取至挥发油提取器中油量不再增加，用无水硫酸钠干燥，精密量取首荟通便胶囊挥发油100 μL，即得供试品溶液，备用。

2.1.2 UPLC-Q-Exactive MS供试品溶液的制备 精密称取首荟通便胶囊内容物0.6 g，置25 mL量瓶中，加50%甲醇超声30 min，放冷，定容，取1 mL稀释10倍，即得。置于冰箱中4 ℃，备用。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取各对照品适量，加甲醇配制成含二苯乙烯苷0.126 mg/mL、柚皮苷0.105 mg/mL、大黄酚0.117 mg/mL、大黄素0.125 mg/mL、芦荟苷0.138 mg/mL、芦荟大黄素0.117 mg/mL、木犀草素0.138 mg/mL、橙皮苷0.112 mg/mL、新橙皮苷0.132 mg/mL的混合对照品溶液，置于4 ℃冰箱内，备用。

2.3 气质条件

2.3.1 色谱条件 Thermo TR-V1色谱柱（30 m×0.25 mm，1.4 μm），以高纯氦气为载气，初始温度为80 ℃，保持5 min，以5 ℃/min速率升温至220 ℃，保持20 min。进样口温度为200 ℃，分流比10∶1，柱体积流量为1.0 mL/min，进样量为0.1 μL。

2.3.2 质谱条件 电离方式为EI，电子能量为70 eV，传输线和离子源温度均为230 ℃，扫描质量范围为/30～500。

2.4 液质条件

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），0.2%甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱（0～25 min，12%～23% B；25～33 min，23%～30% B；33～40 min，30%～70% B；40～42 min，70%～90% B；42～50 min，90% B），体积流量0.2 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为0.8 µL。

2.4.2 质谱条件 电喷雾离子源（HESI），正离子模式，扫描模式为Full MS/dd-MS2，Full MS扫描质量范围为/150～1500，分辨率为70 000，MS2扫描分辨率为17 500，辅助气体积流量10.5 L/min，鞘气体积流量3 L/min，毛细管温度350 ℃，辅助气温度350 ℃，雾化电压3.0 kV，碰撞能量梯度为20、30、40 eV。

2.5 数据处理

气质数据结果经计算机处理后，利用气质工作站NIST 14质谱数据库系统和标准图库对各色谱峰进行检索，并参照相关文献进一步确认挥发油的化学成分，按色谱峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。通过液质质谱所得数据中精确的相对分子质量，在可能的元素组成范围内推断其分子式。并参照相关文献以及TCMSP数据库并结合对照品、特征性多级质谱裂解碎片及相对丰度等信息，分析各化合物裂解规律，进一步确认化学成分。同时，参考相关文献以及TCMSP数据库确定各化合物归属。基于GC-MS和LC-MS技术检测到的成分，结合Q-Marker判断的“五原则”预测首荟通便胶囊的Q-Marker。

3 结果

3.1 化合物的分析与鉴定

首荟通便胶囊气质总离子流图和在正、负离子模式下首荟通便胶囊液质的总离子流图，初步观察发现仪器较稳定且总离子流图清晰，可以用来进行数据分析，且其结果有较高的可靠性。

通过所得数据中的精确相对分子质量，并在可能的元素组成范围内推断其分子式。本实验从首荟通便胶囊中共鉴定出67个化合物，其中通过气质联用技术，从首荟通便胶囊挥发油中共鉴定出7个化合物，包括炔醇类1个和6个脂肪酸类。GC-MS总离子流图见图1，具体化合物信息见表1。

图1 首荟通便胶囊GC-MS总离子流图

通过液质联用技术，从首荟通便胶囊中共鉴定出60个化合物，包括蒽醌类10个、蒽醌苷类5个、糖苷类12个、黄酮类11个、黄酮苷类4个、皂苷类4个、香豆素类2个、萘并吡喃酮类1个、内酯类2个、蒽酮苷类2个、脂肪酸类1个、有机酸类1个、倍半萜类1个、多酚类1个和其他类化合物3个。通过比对9个对照品质谱信息，其中8个化合物与样品质谱鉴定结果相符，分别为二苯乙烯苷（9）、柚皮苷（15）、新橙皮苷（19）、芦荟苷（25）、木犀草素（30）、芦荟大黄素（46）、大黄素（55）、大黄酚（57）。首荟通便胶囊正、负离子的总离子流图见图2，混合对照品负离子总离子流图见图3，正、负离子裂解信息及鉴定结果如表2所示。

表1 首荟通便胶囊挥发油中鉴定的挥发油成分及其相对百分含量

Table 1 Volatile composition and relative percentage content of Shouhui Tongbian Capsule

序号tR/min相对分子质量(m/z)分子式化合物名称相对百分含量/%分类归属 139.688288.208 93C14H28O2肉豆蔻酸[6-8]3.12脂肪酸类枸杞子、决明子、芦荟、人参 243.245284.271 53C18H36O2棕榈酸乙酯[8-10]0.84脂肪酸类枸杞子、决明子、芦荟、人参 343.477254.224 58C16H30O2棕榈油酸[7]0.94脂肪酸类芦荟、决明子 443.783256.240 23C16H32O2棕榈酸[8,10]10.42脂肪酸类枸杞子、芦荟、人参、白术、决明子 545.153244.182 72C17H24O人参炔醇[8,11]1.81炔醇类人参 646.650308.271 53C20H36O2亚油酸乙酯[8,10]0.94脂肪酸类枸杞子、人参 747.150282.255 88C18H34O2反式-13-十八碳烯酸[8]1.15脂肪酸类人参

图2 首荟通便胶囊UPLC-Q-Exactive MS负离子 (A)、正离子 (B) 模式总离子流图

1-二苯乙烯苷 2-柚皮苷 3-橙皮苷 4-新橙皮苷 5-芦荟苷 6-木犀草素 7-芦荟大黄素 8-大黄素 9-大黄酚

3.2 化合物的裂解规律分析

3.2.1 蒽醌类 该类化合物在首荟通便胶囊中数量较多，主要来自芦荟和决明子。蒽醌类化合物在质谱裂解过程中多见苯环上取代基断裂产生的碎片，而游离蒽醌常见依次脱2分子CO后得到丰度很高的离子峰。以化合物46和57为例，在[M－H]−的准分子离子峰分别为269.045 29（C15H10O5）和/253.050 89（C15H10O4）。化合物46首先失去苯环上的羟甲基取代基，得到/240 [M－H－CH2O]−碎片，其次保留共轭体系，失去1分子O，得到/225 [M－H－CH2O－O]−碎片。化合物57首先失去2分子羟基和1分子甲基，得到/207 [M－H－2OH－CH3]−碎片，然后连续脱去2分子CO得到/180 [M－H－2OH－CH3－CO]−和/152 [M－H－2OH－CH3－CO]−碎片。因此，化合物46和57被初步确定为芦荟大黄素和大黄酚。推测裂解途径见图4。

3.2.2 内酯类 该类化合物在首荟通便胶囊中主要来自白术，以化合物58为例，在[M＋H]+的准分子离子峰为/233.153 44（C15H20O2）。可推测其在离子源轰击下内酯首先断裂，得到/187 [M＋H－CH2O2]+、/159 [M＋H－CH2O2－C2H4]+和/145 [M＋H－CH2O2－C3H6]+碎片，其次断裂环烷烃，形成新环烷烃，得到/133 [M＋H－CH2O2－C4H6]+碎片，后继续断裂而产生/105 [M＋H－CH2O2－C4H6－C2H4]+碎片，与文献记载碎片相符，因此，化合物58被初步确定为白术内酯II[25]。其裂解过程见图5。

表2 正负离子模式下首荟通便胶囊的化学成分分析

Table 2 Identification of compounds in Shouhui Tongbian Capsule in positive and negative ion mode

峰号tR/min离子模式相对分子质量 (m/z)偏差(×10−6)碎片离子(m/z)化合物名称分子式归属分类实际值理论值 14.03M－H395.134 00395.134 21−0.53395.134 00, 51.108 34(2'R)-8-C-glucosylaloesol[12]C19H24O9a其他 M＋H397.149 44397.149 86−1.06397.149 44, 53.122 44 25.56M－H409.149 51409.149 86−0.86409.149 51, 47.096 65异芦荟素[12]C20H26O9a蒽醌 M＋H411.165 16411.165 51−0.85411.165 16, 249.102 55 36.19M－H409.115 05409.113 473.84409.115 05, 247.060 84芦荟宁[12]C19H22O10a蒽醌 M＋H411.129 00411.129 13−0.32411.129 00, 249.075 87 49.84M－H405.119 54405.118 562.42405.119 54, 243.065 93顺式-2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷*[13]C24H30O12b糖苷 510.99M－H395.134 70395.134 211.24395.134 70, 275.092 358-C-葡萄糖基-(S)-芦荟醇[13]C19H24O9a其他 M＋H397.148 68397.149 86−2.97397.148 68, 233.080 99 612.42M＋H259.096 47259.097 04−2.20259.096 47异丹叶大黄素[13]C15H14O4 b其他 714.06M－H433.112 30433.113 47−2.70433.112 30, 270.053 1910-羟基芦荟素B[12]C21H22O10a蒽酮苷 814.20M＋H433.110 47433.113 47−6.93433.110 47, 271.057 46异牡荆黄素C21H20O10f黄酮苷 914.98M－H405.118 80405.118 560.59405.118 68, 243.065 83反式-2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷[13]C20H22O9b糖苷 1015.22M＋H289.070 47289.071 22−2.59289.070 47, 242.958 11圣草酚[14]C15H12O6f黄酮 1115.61M－H595.166 81595.166 300.86595.166 81红链霉素-龙胆二糖苷[15]C27H32O15c糖苷 1216.80M－H433.113 16433.113 47−0.72433.113 16, 270.053 2210-羟基芦荟素A[12]C21H22O10a蒽酮苷 1317.47M－H509.166 60509.165 901.37509.166 60, 363.108 438-(α-L-吡喃鼠李糖基)-3-(β-D-吡喃木糖基)[12]C24H30O12a糖苷 1419.18M－H571.182 19571.181 551.12571.182 19, 179.034 12isorabaichromoneC29H32O12a糖苷 M＋H573.196 47573.197 20−1.27573.196 47, 163.039 02 1519.91M－H579.171 57579.171 380.33579.171 57, 271.061 13柚皮苷*[14,16]C27H32O14f黄酮苷 1619.93M－H271.061 16271.060 651.88271.061 16, 151.002 62柚皮素[14,16]C15H12O5f黄酮 M＋H273.075 62273.076 30−2.49273.075 62, 153.018 31 1722.22M－H247.060 85247.060 650.81247.060 85芦荟苷元C13H12O5a蒽醌苷 M＋H249.075 76249.076 30−2.17249.075 76 1822.92M－H301.071 62301.071 221.33301.071 62, 283.047 61橙皮素[14,16]C16H14O6f黄酮 M＋H303.086 24303.086 86−2.05303.086 24, 285.075 23 1923.01M－H609.181 52609.181 95−0.71609.181 52, 301.071 47新橙皮苷*[14,16]C28H34O15f黄酮苷 M＋H611.193 48611.197 60−6.74611.193 48, 303.086 00 2023.03M＋H449.145 36449.144 771.31449.145 36, 165.018 31异樱花苷[14]C22H24O10f黄酮苷 2123.75M－H417.119 17417.118 561.46417.119 17, 297.076 60芦荟苷B[12]C21H22O9a糖苷 M＋H419.133 88419.134 21−0.79419.133 88, 299.091 89 2224.20M－H555.185 49555.186 64−2.07555.185 49, 511.160 31异芦荟树脂D[12]C29H32O11a糖苷 M＋H557.202 03557.202 29−0.47557.202 03, 513.175 72 2324.22M＋H273.075 68273.076 30−2.27273.075 68决明内酯[17]C15H12O5c萘并吡喃酮 2424.43M－H595.166 73595.166 300.72595.166 73, 271.061 04圣草次苷[14]C27H32O15f糖苷 M＋H597.182 50597.181 950.92597.182 50, 273.075 59 2525.96M－H417.118 84417.118 560.67417.118 84, 297.076 63芦荟苷A* [12]C21H22O9a糖苷 M＋H419.134 91419.134 211.67419.137 91 2626.56M－H563.177 06563.176 472.01563.177 06, 401.124 51芦荟糖苷B[12]C27H32O13a糖苷 2728.53M－H431.098 66431.097 831.93431.098 66, 311.092 41大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[13]C21H20O10b蒽醌苷 M＋H433.112 79433.113 47−1.57433.112 79 2829.98M－H563.176 45563.176 47−0.04563.176 45, 401.124 30芦荟糖苷A[12]C27H32O13a糖苷

续表2

*对照品比对后确定的化合物；a-芦荟 b-何首乌 c-决明子 d-白术 e-人参 f-枳实 g-枸杞子；正、负离子模式下均检出的化合物见图2-A

*Compounds identified by comparison with the reference substance; a-b-c-d-e-etf-g-; Compounds detected in both positive and negative ion modes are shown in Fig. 2-A.

图4 芦荟大黄素和大黄酚裂解途径图

3.2.3 皂苷类 该类化合物在首荟通便胶囊中主要来自人参，皂苷类化合物以糖苷键断裂，失去糖基为主要开裂方式。以化合物38为例，在[M－H]−的准分子离子峰为/1 107.594 48（C54H92O23），文献研究表明，在正负离子模式下，C3位糖基取代不易发生断裂，而C20位糖基取代较易发生断裂[26]，所以化合物38首先断裂C20位双糖链，失去2分子葡萄糖，得到/783 [M－H－2glc]−碎片，其次断裂C3位双糖链，再次失去2分子葡萄糖，得到/459 [M－H－2glc－2glc]−碎片，或者连续失去2个葡萄糖分别得到/621 [M－H－2glc－glc]−和/459 [M－H－2glc－2glc]−碎片，因此，化合物38被初步确定为人参皂苷Rb1。裂解过程见图6。

3.2.4 黄酮类 该类化合物在首荟通便胶囊中数量较多，主要来自枳实。该类化合物在质谱裂解过程中容易发生重排、RDA裂解，以及CO、CO2等一些中性分子丢失。以化合物10和31为例，在[M＋H]+的准分子离子峰为/289.070 47（C15H12O6）和/271.059 84（C15H10O5）。化合物10包含3种裂解方式，裂解方式I为准分子离子峰B环开裂，同时C环失去1分子OH，得到/242 [M＋H－CH2O2]+碎片；裂解方式II为准分子离子峰C环断裂，得到/179 [M＋H－C6H6O2]+碎片；裂解方式III为准分子离子峰发生RDA裂解，得到/153和/135碎片。化合物31首先B环开裂并重排，生成中间体，其次C环上丢失C2H2O碎片，得到/229 [M＋H－C2H2O]+碎片。因此，化合物10和31被初步确定为圣草酚和芹菜素。裂解途径见图7、8。

图5 白术内酯II裂解途径图

图6 人参皂苷Rb1裂解途径图

图7 圣草酚裂解途径图

图8 芹菜素裂解途径图

3.3 潜在Q-Marker预测

Q-Marker的研究和确定应基于有效、特有、传递与溯源、可测和处方配伍的“五原则”，既反映了与有效性和安全性的关联关系，又体现中药成分的专属性、差异性特征，体现针对疾病的中药有效性表达方式及其物质基础的客观实质[27-28]。首荟通便胶囊现有质量标准检测的指标成分相对简单，很难真正反映药物整体质量。基于GC-MS和LC-MS技术检测到的成分，结合Q-Marker判断的“五原则”预测首荟通便胶囊的Q-Marker，以期为提高该药物的整体质量控制水平提供参考。

3.3.1 基于质量传递与溯源的Q-Marker预测分析 本研究采用GC-MS和LC-MS技术从首荟通便胶囊中共鉴定出67个化合物，含7种挥发性成分和60种非挥发性成分。其中挥发性成分主要包括炔醇类1个和6个脂肪酸类；非挥发性（或不易挥发性）成分主要包括蒽醌类10个、蒽醌苷类5个、糖苷类12个、黄酮类11个、黄酮苷类4个、皂苷类4个、多酚类1个，香豆素类2个、萘并吡喃酮类1个、内酯类2个、蒽酮苷类2个、脂肪酸类1个、有机酸类1个、倍半萜类1个和其他类化合物3。所有化合物都找到了具体的归属，其中何首乌、芦荟共鉴定出33个成分；决明子和枸杞子共鉴定出18个成分，另外由于阿胶中主要含有多种氨基酸，这类成分极性较大且不易被常规色谱柱分离，因此本研究中基本没鉴别出氨基酸类成分。人参、白术中共鉴定出13个成分；枳实中共鉴别出16个成分。

梁红宝等[18]利用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）和中药分子机制的生物信息学分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechANism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM）查找首荟通便胶囊中“何首乌”“芦荟”“决明子”“枸杞子”“阿胶”“人参”“白术”“枳实”相关的分子信息。按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeniss，DL）≥0.18的条件筛选并剔除无对应靶点的成分，得到92个化合物。其中大多与本研究中鉴定的化合物一致。

3.3.2 基于复方配伍与成分特有性的Q-Marker预测分析 首荟通便胶囊方中的何首乌和芦荟为君药，具有润肠通便、清肝泻热以及益精养血的功效；决明子与枸杞子以及阿胶共为臣药，具有滋补肝肾、清肝明目、滋阴润燥通便、补血止血的功效；人参与白术则为佐药，具有补气健脾的功效，且可促使泻不伤正；并以枳实破气消积，引经入药，共奏益气养阴、补泻兼施、标本兼治之功[29-30]。何首乌中主要存在二苯乙烯苷类、蒽醌糖苷类及白藜芦醇等化合物为主的特有成分[31]；蒽醌类成分是芦荟的主要功效物质，且以芦荟苷、芦荟大黄素等成分为主[32]；决明子中主要有橙黄决明素、决明素及决明子苷等特征性成分[33]；枸杞子除含枸杞多糖等大分子成分外，还有槲皮素、异绿原酸、亚麻酸等小分子成分[34]；阿胶中主要含-羟脯氨酸、赖氨酸和精氨酸等多种氨基酸类成分[35]；人参炔醇类挥发性成分为人参特有，且还含有人参皂苷Rf、Rb1、Rc和Rb2等多种皂苷类成分[36]；白术中的白术内酯、苍术酮等为特征性成分[37]；枳实中主要含有新橙皮苷、川陈皮素和柚皮素等多种黄酮类化合物[38]。

3.3.3 基于成分与有效性关联的Q-Marker预测分析 何首乌中含有的2,3,5,4-四羟基二苯乙烯- 2β葡萄糖苷显示出多种生物活性，如调血脂、抗氧化、抗肿瘤等[31]；芦荟中芦荟苷、芦荟大黄素等成分具有润肠通便、抗炎、抗菌、保护肝脏和神经的多重活性[32]；决明子、枸杞子、阿胶和枳实所含有的槲皮素、决明素、决明内酯、木犀草素、柚皮素等多种黄酮、内酯类成分、氨基酸类成分及枸杞多糖等大分子成分具有调节消化系统、滋润胃肠道、调脂、抗炎[33-35,38]等作用；人参、白术中含有的丰富的人参皂苷、苍术内酯、苍术酮等活性分子具有提高免疫力的作用[36-37,39]，类似于扶正、健脾的功效。

郭强等[40]通过分析靶点蛋白的生物学功能，发现首荟通便胶囊主要通过作用于三羧酸循环、嘧啶代谢、硫代谢、脂肪酸降解及氨基酸代谢相关通路的靶点蛋白群，发挥促进肠道动力学、抗炎、改善肠道细胞屏障功能、改善肠道水分泌、改善肠道菌群等多种作用，最终发挥润肠通便的临床药效。梁红宝等[18]通过网络药理学方法研究发现，首荟通便胶囊中多种活性成分通过作用于RAC-α-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、白细胞介素6（interleukin-6，IL6）、活化蛋白1（activator protein 1，AP1）等关键靶点，调节多条信号通路，增加肠道的滑润度和蠕动功能，保证肠道管腔通畅，发挥治疗便秘的作用。其中degree值较高的化合物有：槲皮素（枸杞子和芦荟）、白藜芦醇（何首乌）、赖氨酸（阿胶）、大黄素（何首乌、芦荟）、芦荟大黄素（芦荟）、木犀草素（枳实）、柚皮素（枳实）、川陈皮素（枳实）等，可能为关键活性组分，协同治疗、共同起效。

综上分析可知，二苯乙烯苷类、芦荟大黄素、枸杞多糖、槲皮素、决明素、柚皮素、人参皂苷和苍术酮等成分在首荟通便胶囊临床治疗中发挥了重要作用，可以作为首荟通便胶囊Q-Marker的预测分析。

3.3.4 基于成分可测性的Q-Marker预测分析 中药成分复杂，明确有效成分无疑是研究药效的关键所在，Q-Marker应具备可测性。彭艳等[4]采用HPLC-MS/MS法，以电喷雾离子源，通过SIM模式，同时测定了何首乌中大黄素、芦荟中芦荟大黄素、决明子中橙黄决明素、枸杞子中枸杞多糖、阿胶中羟脯氨酸、人参中人参皂苷、白术中苍术酮、枳实中橙皮苷等8种成分。马云等[5]建立了测定首荟通便胶囊中2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2β葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素和大黄酚7种成分的HPLC方法。关永霞等[41]采用HPLC波长切换法，同时测定其中2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2β葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷和芦荟苷4种活性成分的含量，该法简便、快速、准确，可更为全面、客观评价首荟通便胶囊的质量提供参考依据。

根据“五原则”的复方中药Q-Marker研究思路，在Q-Marker预测分析过程中，发现首荟通便胶囊成分复杂繁多，采用通过常规技术难以实现分离鉴别，故而应当选取成分特有、与首荟通便胶囊药效关联且便于检测的化合物。综上可知，2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2β葡萄糖苷、芦荟大黄素、橙黄决明素、槲皮素、-羟脯氨酸、人参皂苷、苍术酮和柚皮素等与首荟通便胶囊有效性较为密切，且廉价易得、特征性强、可测性好，可视为首荟通便胶囊的Q-Marker。

4 讨论

首荟通便胶囊具有养阴益气、泻浊通便之功效。用于功能性便秘，中医辨证属气阴两虚兼毒邪内蕴证者，症见便秘、腹胀、口燥咽干、神疲乏力、五心烦热，舌质红嫩或淡，舌苔白或白腻，脉沉细或滑数。

本实验首次对首荟通便胶囊的挥发油进行定性鉴定，通过气质数据库匹配，从挥发油中共鉴定出7个化合物，包括炔醇类1个和6个脂肪酸类，含量均非常低，不宜作为指标成分进行含量检测。液质实验前期，为筛选最佳提取方法，分别用水、50%甲醇水溶液、甲醇作为提取溶剂，考察最佳提取溶剂和提取时间，结果表明采用50%甲醇水超声提取30 min时，各分析物出峰多、响应好、提取率最高，提取效果最优。通过质谱信息并结合对照品、相关文献、数据库检索，液质联用共鉴别出了60个化合物，包括蒽醌类10个、蒽醌苷类5个、糖苷类12个、黄酮类11个、黄酮苷类4个、皂苷类4个、香豆素类2个、萘并吡喃酮类1个、内酯类2个、蒽酮苷类2个、脂肪酸类1个、有机酸类1个、倍半萜类1个、多酚类1个和其他类化合物3个。与文献报道的化合物相比，鉴定出的化合物数量偏少，主要原因可能是极性大的小分子化合物，如阿胶中的多种氨基酸，往往需要特殊的色谱柱进行衍生检测，本研究选择了通用型广谱性色谱柱，会造成部分成分的缺失；另外，有些化合物在药材中的含量极微，而在提取、制剂过程中损失掉一部分，从而造成无法检出的情况。通常来讲，制剂中可检测到的，能够吸收入血的化合物才可能为药效成分。目前未检索到关于首荟通便胶囊入血成分相关的文献报道，下一步本课题组可开展相关研究。

本研究在鉴定首荟通便胶囊化学成分的基础上，以中药Q-Marker新概念为指导，从质量传递与溯源、复方配伍、化学成分特有性、有效性及成分可测性等5个方面对首荟通便胶囊Q-Marker的筛选进行初步分析和论证，预测出2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2β葡萄糖苷、芦荟大黄素、橙黄决明素、槲皮素、-羟脯氨酸、人参皂苷、苍术酮和柚皮素8种活性成分可作为首荟通便胶囊治疗便秘的Q-Marker。本研究将为阐释该药物药效物质基础及质量标准提升方面提供重要的数据支持。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Study on quality markers of Shouhui Tongbian Capsule based on GC-MS and UPLC-Q-Exactive MS technology

LIANG Hong-bao1, 2, 3, SUN Jian-zhi2, 3, JIANG Yu-jun2, 3, YUAN Xiao-mei2, YAO Jing-chun2, 3, GUAN Yong-xia2, ZHANG Gui-min1, 2, 3, LI Feng1

1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China 2. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China 3. Shandong New Time Pharmaceutical Co., Ltd., Linyi 276006, China

To systematically analyze the chemical composition and fragmentation law of Shouhui Tongbian Capsule (首荟通便胶囊), and explore its potential quality markers for the treatment of constipation.The chemical constituents of Shouhui Tongbian Capsule were qualitatively analyzed by GC-MS and UPLC-Q-Exactive MS. And according to the “five principles” of Q-Marker, the potential Q-Marker is studied.Seven compounds (one alkynols and six fatty acids) were identified from essential oil by GC-MS. And a total of 60 compounds (10 anthraquinones, five anthraquinone glycosides, 12 glycosides, 11 flavonoids, four flavonoid glycosides, four saponins, two coumarins, one naphthopyrones, two lactones, two anthrone glycosides, one fatty acid, one organic acid, one sesquiterpenoid, one polyphenol and three other compounds) were identified by UPLC-Q Exactive MS and combined with reference materials, related literature, database retrieval. Combining the principles of effectiveness, specificity, transmission and traceability, measurability and prescription compatibility, 2,3,5,4-tetrahydroxy stilbene-2-- βglucoside, aloe emodin, aurantio-obtusin, quercetin,-hydroxyproline, ginsenoside, atractylone and naringenin may be the Q-Marker of Shouhui Tongbian Capsule.In this study, the separation and identification methods of Shouhui Tongbian Capsule by GC-MS and UPLC-Q Exactive MS were established, and the Q-Marker of Shouhui Tongbian Capsule was predicted, which provided a basis for explaining the functional material basis and improving the quality standard of Shouhui Tongbian Capsule.

GC-MS; UPLC-Q Exactive MS; Shouhui Tongbian Capsule; fragmentation law; Q-Marker; 2,3,5,4-tetrahydroxy stilbene- 2--βglucoside; aloe emodin; aurantio-obtusin; quercetin;-hydroxyproline; ginsenoside; atractylone; naringenin

R284.1

A

0253 - 2670(2022)21 - 6674 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.004

2022-07-12

山东省重点研发计划（重大科技创新工程）（2021CXGC010508）

梁红宝（1985—），男，山东济宁人，博士研究生，研究方向为中药创新药物。Tel: 18764932621 E-mail: lianghongbao1985@163.com

李 峰（1957—），男，教授，博士生导师，研究方向为中药质量控制与资源。E-mail: 13969141796@163.com

[责任编辑 王文倩]