油菜素内酯对水稻耐旱性的影响研究

潘 根，姜 慧*，孙志广

（1.中国农业科学院 麻类研究所，湖南 长沙 410205；2.江苏徐淮地区连云港农业科学研究所，江苏 连云港 222006）

水稻（Oryza sativa）是重要的粮食作物之一，养活了世界上超过一半的人口［1］。干旱是影响水稻等农作物生长和产量的主要非生物胁迫因素，严重威胁着粮食安全［2］。在干旱胁迫下，植株内部结构、生理指标及转录水平改变，如气孔闭合、根系形态结构改变、渗透相关物质积累及抗性基因表达量改变，这些是应对干旱胁迫的重要策略之一，而植物激素在这个策略中发挥了重要作用［3］。

前人研究表明，胁迫相关激素如脱落酸（ABA）、乙烯（ETH）、茉莉酸（JA）等直接参与了植物的干旱胁迫反应。过表达ABA途径相关基因PYL10、SnRK2、OsABA8ox3通过激活ABA信号途径及增加ABA含量来提高水稻植株的耐旱性［4-6］。过表达乙烯（ETH）响应因子JERF1能够增强水稻的耐旱性，主要通过增加脯氨酸含量、激活胁迫相关基因的表达以及降低水分流失［7］。外源喷施茉莉酸（JA）后能够通过提高水稻SOD、POD等抗氧化酶的活性，从而提高植株的耐旱性，而过表达茉莉酸信号抑制子JAZ9能够增加水稻对干旱的敏感性［8］。除了ABA、JA、ETH等胁迫相关激素外，生长素类激素如生长素（IAA）、细胞分裂素（CK）也被报道参与了水稻耐旱性的调控。过表达生长素信号相关基因，如OsPIN3t、OsIAA6等可以通过增加根系数目来增加水稻对干旱胁迫的耐性［9-10］。CK可以通过增加植株光合作用即碳同化能力来增强水稻的耐旱性［11］。此外，油菜素内酯（BR）也被报道参与了植株的耐旱反应［12］。在植株和小麦中，BR信号途径相关基因BZR1正调控拟南芥的耐旱性，主要是通过提高渗透来保护代谢物含量及促进胁迫相关基因表达来提高植株的存活率［13-14］。与拟南芥、小麦研究结果相反，在番茄中，过表达BR受体基因BRI1降低了植株ABA的含量及SOD、POD酶活性，从而负调节植株的耐旱性［15］。但BR在水稻植株耐旱性方面的作用至今未有相关报道。为此，本研究通过对干旱胁迫下外源BL处理水稻植株进行耐旱表型鉴定、生理生化指标测定及胁迫相关基因表达量分析，初步阐明BR在水稻耐旱中的功能及其作用机理，研究结果对水稻抗旱栽培及耐旱新品种培育具有重要的理论和实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物 水稻品种9311来自连云港市农业科学研究院。

1.1.2 试剂 RNA提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，表油菜素内酯（BL）购自美国Sigma公司，Evo M-MLV反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自湖南艾科瑞生物有限公司，引物由湖南擎科生物科技有限公司合成。

1.2 水稻耐旱表型鉴定

水稻品种9311种子浸种催芽后，当出芽长约0.5 cm时，选择活力一致的种子播种于直径为10 cm的黑色营养钵中，每天保持正常浇水，植株培养至3叶1心时待处理。在BL对水稻耐旱性影响的研究中，首先将BL溶解于无水乙醇中，并稀释至BL浓度为1 μmol（乙醇浓度为0.1%）后，再用喷壶对植株叶片进行外源喷施，喷至叶片有水滴落出后停止喷施。处理组为1 μmol BL，对照组为仅含0.1%乙醇水溶液，喷施1 d后进行干旱胁迫处理，7 d后进行植株存活率统计。每个处理3次重复。

1.3 RNA提取及基因定量分析

分别将供试材料浸种催芽，当种子出芽长约0.5 cm时，选择活力一致的种子播种于直径为10 cm的黑色营养钵中，每个营养钵播种25粒，每天保持正常浇水，待植株培养至3叶1心时停止浇水，分别于停止浇水时、停止浇水后第1、2及4天取植株根系组织冷冻后存储于-80 ℃冰箱中待用。

用RNA提取试剂盒提取干旱处理植株根系组织总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和纯度，用Nano Drop 2000超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific，USA）检测其浓度和纯度。

使用Evo M-MLV反转录试剂预混液将总RNA反转为cDNA。选用OsActin为内参基因，在CFX96荧光定量PCR仪（Bio-Rad，USA）上以SYBR Green I为荧光染料，反应条件为95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。用于基因定量表达分析的引物如表1所示。

表1 qRT-PCR所用引物

1.4 胁迫相关生理指标测定

分别提取干旱胁迫第2、第4天水稻品种9311的根系用于POD酶活性、SOD酶活性及MDA含量测定。POD、SOD酶活性及MDA含量测定具体方法参考南京建成生物有限公司生产的POD、SOD及MDA试剂盒说明书。叶片相对含水率测定步骤如下：首先剪取0.1 g水稻幼苗叶片，用锡箔纸包好后称重记为鲜重FW，并将样品置于烘箱100 ℃杀青1 h，然后80 ℃恒温烘24 h后称重，记为干重DW。每个处理3次重复。植物含水率公式为：

1.5 数据统计与分析

采用Excel 2010软件进行数据分析和图表绘制，利用SPSS软件进行单因素方差分析，采用t检验进行干旱处理BR和ABA途径相关基因表达量、外源BL处理与对照间存活率、鲜重及生理指标的差异性分析。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对BR途径相关基因表达量的影响

为了探究BR在干旱胁迫响应中的作用，对干旱胁迫处理下水稻品种9311根系组织中BR途径相关基因进行了表达量分析。OsBRD2、OsD2、OsD11为BR合成途径相关基因，OsBRI1、OsBZR1为BR信号途径相关基因。如图1所示，干旱胁迫下，BR途径相关基因表达量呈现出不同程度的下降趋势，且在干旱胁迫处理第2、第4天，基因表达量显著下降，特别在第4天的表达量最低，其表达量不到干旱胁迫处理前的一半。研究结果表明，干旱胁迫抑制了BR途径相关基因的表达。

2.2 外源喷施BL对植株干旱胁迫的影响

鉴于BR途径相关基因表达受到了干旱胁迫的抑制，为了进一步探究BR在水稻干旱胁迫响应中的作用，本文研究了外源BL喷施对水稻植株耐旱性的影响。如图2所示，干旱胁迫第7天，外源喷施1 μmol BL处理植株存活率低于10%，而对照的存活率接近80%（图2b）。研究还发现，干旱胁迫7 d后，对照植株的鲜重显著高于BL处理的（图2c）。这些结果表明，外源喷施BL增加了植株对干旱胁迫的敏感性。

2.3 干旱胁迫下外源BL对植株SOD活性、POD活性、MDA含量及相对含水率的影响

为了探究BR负调控水稻耐旱性的生理机制，测定了干旱胁迫2和4 d后BL处理及其对照的植株胁迫相关生理指标。如图3所示，干旱胁迫处理2 d后，BL处理植株根系中POD活性显著低于未处理植株的，其活性约为未处理植株的50%，而MDA含量显著高于对照植株的；干旱胁迫处理4 d后，BL处理植株根系中POD活性、SOD活性及相对含水率均显著低于对照植株，而MDA含量显著高于对照，约为未处理植株的1.8倍。

2.4 干旱胁迫下BR对ABA途径相关基因表达量的影响

据报道ABA能够正向提高植物的耐旱性［4］。为了探究BR负调节水稻耐旱性的作用机制，对外源BL处理植株进行了ABA途径相关基因表达量的测定。由图4可知，干旱胁迫处理4 d后，BL处理植株根系中OsNCED5、OsABI5、OsABI3及OsbZIP23基因表达量均显著低于对照植株，其中OsABI5、OsABI3及OsbZIP23的表达量约为对照植株的1/3。研究结果表明，BR负调控水稻的耐旱性可能与ABA途径相关基因下调表达量有关。

3 讨论

BR是一类生长素类激素，被广泛报道参与了植物的生长和发育的调控［16］。前人研究也表明，BR参与了植物耐旱性的调控。外源喷施BL能够提高拟南芥、番茄的耐旱性，过表达BR信号基因BZR也能够提高小麦、拟南芥的耐旱性，这些研究表明BR能够正向调控植物的耐旱性［13-14，17-18］。与之相反，在干旱胁迫下，BR合成及信号关键基因突变后，其植株存活率提高，暗示了BR能负调控植物的耐旱性［19-21］。本研究中，干旱胁迫抑制了BR途径相关基因的表达，外源BL处理后增加了水稻植株对干旱的敏感性，表明BR能负调控水稻植株耐旱性，这与Northey等［22］的研究结果类似。

干旱胁迫能导致活性氧积累，使植物体内发生氧化胁迫，从而增加了膜脂过氧化物MDA的含量。作为植物耐旱的主要策略之一，植株通过SOD酶和POD酶清除植株体内多余的活性氧，从而减轻对植株的损伤［23］。番茄过表达BR受体基因BRI1后，植株SOD和POD酶活性下降，MDA含量上升，从而提高了植株对干旱的敏感性［15］。本研究也发现，BL处理植株中SOD和POD酶活性低于对照植株的，表明外源BL处理减弱了植株的抗氧化能力，同时MDA含量的上升也表明其植株受到比对照更严重的氧化损伤。

Nolan等［12］研究表明，BR主要通过与ABA相互作用来调控植物的耐旱性。本研究发现，在干旱胁迫下，ABA途径相关基因在BL处理植株中的表达量均低于对照植株，通过进一步研究发现，BR对OsABI3和OsABI5的表达量影响最为显著（图4）。研究结果表明，OsABI3和OsABI5可能对BR负调节水稻耐旱性起到了关键作用。Liu等［24］研究表明，BR可以通过转录因子BZR直接结合OsABI5的启动子区域来抑制基因的表达量，从而负调控植物的耐旱性，在水稻中BR是否通过这条路径来负调节水稻耐旱性还需进一步研究。

4 结论

在干旱胁迫下，BR信号途径相关基因的表达量受到抑制，外源BL处理降低了根系中SOD和POD酶活性，抑制了ABA途径相关基因的表达量，导致根系中MDA含量的升高，叶片相对含水量降低，从而增加了植株对干旱胁迫的敏感性。本研究初步明确了BR在水稻耐旱性中的功能及作用机制，为水稻的抗旱栽培及育种研究奠定了理论基础。