生物蛋白API对肉鸡生长性能和肠道健康的影响

2022-11-02彭春芳唐昱婷赵婉馨刘光芒蔡景义汤加勇

四川农业大学学报 2022年5期

彭春芳，赵华，唐昱婷，赵婉馨，贾刚，刘光芒，田刚，蔡景义，汤加勇

（四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，农业农村部动物抗病营养与饲料重点实验室，动物抗病营养四川省重点实验室，成都 611130）

在集约化养殖中，抗生素的使用给养殖业带来了巨大的经济效益，但长期滥用抗生素导致药物残留和细菌耐药性增加，给人类健康和生态系统带来极大危害。2020年7月1日起，我国实行全面禁抗，研制高效且安全的抗生素替代物势在必行。抗菌肽具有广谱抗菌活性、抗病毒能力强和无残留等优点，已成为替抗的新型饲料添加剂，具有广泛应用前景。抗菌肽根据来源可分为：植物源、动物源、微生物源和人工合成等来源抗菌肽；根据蛋白质次级结构可分为：α-螺旋型抗菌肽、β-折叠型抗菌肽、环形抗菌肽和延伸型抗菌肽。不同来源的抗菌肽，根据其结构、作用靶点部位以及抗菌方式的不同，其抑菌效果相差很大。

鲶鱼抗菌肽（parasin I，PI）是一种从受伤鲶鱼体表黏液中分离出的广谱抗菌肽，具有11%的α-螺旋、33%的β-折叠、56%的无规则卷曲，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌均表现出较高的抗菌活力，且无溶血活性[1-2]。PI抗菌效果是抗菌肽Maganin 2的12～100倍、BuforinⅠ的8倍，具有较高的研究和应用价值[1]。但天然PI直接分离纯化较为困难，限制了其在生产中的应用。前期我们在大肠杆菌系统中成功表达了重组抗菌肽PI，发现PI对金黄色葡萄球菌具抑制作用[3]。在此基础上我们进一步采用合成生物学技术，人工设计全新的生物蛋白API（Artificial parasinⅠ，含PI功能片段的基因工程蛋白）并实现了其在毕赤酵母中的高效表达，体外实验发现激活的API对革兰氏阴性菌等病原微生物具有抑制作用[4]。张莉在饲粮中添加API能降低肉兔腹泻率，改善肠道健康[5]。但API是否可提高家禽生长性能和改善其肠道健康还有待进一步研究。因此，本研究将API添加到肉鸡饲粮，旨在探究其对肉鸡生长性能和肠道健康的影响，进而为其在畜禽生产应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

生物蛋白API（含PI功能片段）为本实验室构建、表达后的发酵液用吸附剂吸附干燥后的产物，API蛋白含量约8.5 g/kg；爱拔益加（AA）肉鸡购自正大食品遂宁有限公司。

1.2 试验设计

试验采用单因素试验设计，将450羽1日龄AA肉公鸡随机分为5组，对照组（饲喂基础饲粮）和4个水平API添加组（在基础饲粮中分别添加API 250、500、750、1 000 mg/kg），每组10个重复，每个重复9只鸡。试验期为42 d，分1～21 d和22～42 d两阶段饲养。基础饲粮参照中国肉仔鸡饲养标准（NY/T 33—2004）营养需要量并结合生产实际分两阶段配制，饲粮配方见表1。饲料形态为粉料。

表1 饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Ingredient and chemical composition of diets(air-dried basis) %

1.3 饲养管理

饲养试验在四川农业大学动物营养研究所教学科研基地进行。采用网上笼养，自由采食和饮水。前1～7 d温度保持32～34℃，7 d后每周温度降低2～3℃，直至保持在20～22℃；相对湿度保持在50%～65%，连续光照。免疫程序按常规进行，每日观察并记录鸡只健康状况。

1.4 样品采集及指标测定

1.4.1 生长性能

以重复为单位，于试验第1、21和42天早上对鸡只进行空腹称重，每周记录每个重复的给料量、余料量及料损。计算阶段平均日增重（ADG），平均日采食量（ADFI）和料肉比（F/G）。

1.4.2 样品采集

饲养试验结束后，按平均体重每个重复选1只健康肉鸡进行屠宰；取十二指肠、空肠和回肠中段各2～3 cm经生理盐水冲洗后立刻放入4%多聚甲醛溶液中固定、保存备用；取十二指肠、空肠和回肠黏膜样和盲肠内容物于冻存管中，于液氮中速冻后置于-80℃保存备用。

1.4.3 肠道组织形态指标测定

将保存于4%多聚甲醛溶液中的肠段每个处理组随机取3个样进行石蜡切片制作，观察并测定绒毛高度（villus height,VH）和隐窝深度（cypt depth,CD）。每个样品至少制作3张切片，每张切片选择10个完好无损的视野测量VH和CD并计算绒隐比（villus height/cypt depth,V/C）。

1.4.4 空肠消化酶活测定

空肠黏膜中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活性测定均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定（No.C016-1-1、No.A080-2-2、No.A080-3-1、No.A054-1-1），具体操作步骤按说明书严格进行。

1.4.5 肠道相关基因表达测定

用RNAiso Plus（No.9109,Takara）提取肠黏膜总RNA；用 PrimeScriptTMRT reagent Kit（No.RR047A,Takara）将RNA反转录成cDNA；再用SYBR Green®Primix Ex TaqTMⅡ Kit（No.RR820A,Takara）对黏膜中紧密连接蛋白相关基因（ZO-1、ZO-2、CLDN-1、CLDN-2、OCLN、MUC2）和免疫相关基因（IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ）进行实时荧光定量PCR检测。定量引物用Primer Express 3.0（Applied Biosystems）软件设计，送上海生工生物公司合成。

1.4.6 盲肠微生物菌群测定

盲肠食糜总DNA用粪样DNA提取试剂盒（No.D4015-01,Omega）提取，总菌数量用SYBR®Green染色法（No.Q711-02/03,Vazyme）检测；大肠杆菌和乳酸杆菌数量用TaqMan探针法（No.Q513-02/03,Vazyme）检测。具体引物和探针序列见参考文献[5]。

1.5 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2019进行初步整理后，用SPSS 26.0统计软件中One-way ANOVA程序对5个处理组数据进行单因素方差分析，差异显著运用图基（Tukey）法进行多重比较，用SPSS 26.0统计软件中的回归-曲线估算对每个处理组数据进行线性及二次回归分析。以P＜0.05为差异显著，以P＜0.01为差异极显著，以0.05≤P＜0.10为有趋势水平；试验数据采用平均值和均值标准误表示。

2 结果与分析

2.1 API对肉鸡生长性能的影响

由表2可知，API添加对肉鸡0～21、21～42和0～42 d的BW、ADG和ADFI无显著影响（P＞0.05），但500 mg/kg的API添加组鸡只末重较对照组提高了79.62 g/只；当API添加为500 mg/kg时，鸡只在后期及全期的F/G较对照组均有所下降，但未达显著水平（P＞0.05）。

表2 API对肉鸡生长性能的影响Table 2 Effects of API supplementation on growth performance of broilers

2.2 API对肉鸡肠道形态的影响

由表3可知，与对照组相比，API添加显著降低了肉鸡空肠的CD（P＜0.05）、显著增加了空肠V/C（P＜0.05）；API添加具有降低回肠CD的趋势（P=0.098），其中500和750 mg/kg API添加较对照组回肠CD分别降低了27.38%和13.45%；空肠CD和V/C与API添加水平呈二次线性变化（P=0.008）。

表3 API对肉鸡肠道形态的影响Table 3 The effect of API supplementation on the intestinal morphology of broilers

2.3 API对肉鸡空肠消化酶活的影响

由表4可知，与对照组相比，API添加有提高空肠黏膜中α-淀粉酶活性的趋势（P=0.09），且500 mg/kg API组α-淀粉酶活性最高并呈现二次线性变化（P=0.033）；500 mg/kg API组较对照组脂肪酶和胰蛋白酶活性分别提高了9.08%和9.06%。

表4 API对肉鸡空肠消化酶活的影响Table 4 Effects of API supplementation on jejunal digestive enzyme activity of broilers

2.3 API对肉鸡盲肠微生物数量的影响

由表5可知，与对照组相比，API添加显著增加了肉鸡盲肠中的总菌数量（P＜0.01），在降低了大肠杆菌数量的同时增加了乳酸杆菌数量（P＞0.05）；其中750 mg/kg API组显著降低了大肠杆菌数量（P＜0.05）、显著增加了乳酸杆菌数量（P＜0.01）；盲肠中总菌、乳酸杆菌和大肠杆菌数量与API添加水平呈二次线性相关（P＜0.01）。

表5 API对肉鸡盲肠微生物数量的影响Table 5 The effect of API supplementation on the number of microorganisms in the cecum of broilers

2.4 API对肉鸡肠道紧密连接蛋白基因表达量的影响

API对肉鸡肠道紧密连接蛋白相关基因表达量的影响如图1所示。从图中可知，与对照组相比，250 mg/kg API添加一定程度上调了十二指肠MUC2的表达（P＞0.05），1 000 mg/kg API添加显著上调了空肠黏膜中OCLN的表达（P＜0.05）；API添加对肉鸡十二指肠和回肠的紧密链接蛋白相关基因表达量无显著影响（P＞0.05）。

图1 API对肉鸡肠道紧密连接蛋白基因表达的影响Figure 1 The effect of API supplementation on the expression of tight junction protein genes in the gut of broilers

2.5 API对肉鸡肠道免疫相关基因表达的影响

API对肉鸡肠道免疫相关基因表达的影响见图2。与对照组相比，500和750 mg/kg API组显著下调了十二指肠中TNF-α的表达（P＜0.05）（图2A）；API添加显著下调了空肠中TNF-α和IFN-γmRNA的表达（P＜0.05），同时750 mg/kg API添加显著上调了空肠IL-10的表达（P＜0.05）（图2B）；但API添加对回肠免疫相关基因无显著影响（P＞0.05）（图2C）。

图2 API对肠道免疫相关基因表达的影响Figure 2 The effect of API supplementation on the expression of intestinal immunity-related genes

3 讨论

抗菌肽广泛应用于畜禽养殖业中，其在预防和治疗动物疾病方面具有良好效果，且可通过抑制并杀死病原菌、维护肠道平衡和增强机体免疫等方式提高动物生长性能。研究发现，肉鸡饲粮添加抗菌肽AMP-P3和Plectasin可显著增加其日增重并降低料重比，改善其生长性能[6-7]。在山羊饲粮中添加抗菌肽PBD-ml和LUC-n，可改善瘤胃微生物群结构、提高饲料转化率和生长性能[8]。抗菌肽AD对正常生理状态下仔猪的生长性能无显著影响，但可显著提高大肠杆菌攻毒状态下仔猪生长性能[9]。本研究中，饲粮添加API对鸡只的生产性能改善虽未达到显著水平，但在一定程度上可提高鸡只末重，特别是500 mg/kg API组鸡只末重较对照组提高了79.62 g/只。表明API对家禽动物的生产性能具有一定的改善功能。

肠道是营养物质吸收的主要部位，肠道形态的完整性与肠道健康密切相关，绒毛高度、隐窝深度和绒隐比是评估肠黏膜损伤程度和小肠吸收能力的主要指标[10]。抗菌肽进入动物肠道后可通过刺激肠上皮细胞的增殖促进绒毛生长进而改善肠道形态[7]，如肉鸡饲粮添加猪抗菌肽（SGAMP）可有效缓解慢性热应激对肉鸡肠道形态结构的影响，增加肠道绒毛高度和肠黏膜厚度[11]；添加抗菌肽MccJ25可显著提高在大肠杆菌和沙门氏菌攻毒情况下肉鸡十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度、隐窝深度和绒隐比[12]。本研究中，API添加显著降低了空肠隐窝深度并显著增加了空肠绒隐比，但对十二指肠和回肠形态无显著影响，与Peng Z.X.等[13]研究结相似。SGAMP[11]、MccJ25[12]可缓解应激对肉鸡肠道形态的损伤，本试验条件下鸡只处于正常饲养条件，但API添加依然改善了空肠的形态结构。肠道中消化酶主要由小肠黏膜上皮细胞和胰腺分泌，消化酶分泌不足会影响肠道对营养物质的吸收[14]。肉鸡饲粮中添加抗菌肽可显著增加十二指肠胰蛋白酶和脂肪酶的活性[15]，添加抗菌肽Gal-13可显著增加空肠淀粉酶活性，但对蛋白酶活性无显著影响[16]。添加抗菌肽Plectasin提高了肉鸡十二指肠胰蛋白酶和脂肪酶活性[7]。本研究发现，API添加具有提高空肠黏膜中α-淀粉酶活性的趋势，一定程度提高了空肠中各消化酶活性，这与抗菌肽Gal-13[16]、Plectasin[7]在肉鸡中对肠道消化酶活的作用效果相类似。以上结果表明，API可能通过维护肠道形态的完整性，提高肠道中消化酶活性，从而提高对营养物质的吸收能力，进而改善肠道健康。

肠道微生物菌群的稳定可反映肠道健康状况，菌群的改变可影响肠道对营养物质的吸收[17]。抗菌肽可抑制肠道内有害菌群的数量和促进有益菌的定植，从而改善肠道健康[6]。饲粮添加抗菌肽MccJ25可降低猪粪便中大肠杆菌数量、增加双歧杆菌和乳酸杆菌数量，可有效改善粪便微生物群组成[18]。断奶仔猪饲粮中添加复合抗菌肽可显著增加肠道乳酸杆菌数量并显著降低大肠杆菌数量[19]。本研究发现，API添加降低了肉鸡盲肠中大肠杆菌数量、增加了总菌数和乳酸杆菌数量，与抗菌肽MccJ25[18]和复合抗菌肽[19]在仔猪中、cLF36在禽中[20]可显著降低肠道中大肠杆菌数量的结果相似，表明API可通过改善肉鸡盲肠中的微生物群结构进而促进肠道健康。

肠道屏障包括物理屏障、化学屏障、免疫屏障和微生物屏障，它们共同抵抗外部环境给肠道带来的刺激，有效防止病原微生物的入侵[21]。肠道是肠腔与内环境之间的第一道防线，紧密连接蛋白是其重要组成结构，主要有Occludin、Claudins和ZOs等[22]，它们调控着肠道上皮通透性并反映肠道屏障功能缺陷情况。黏蛋白2（MUC2）是肠道黏液层的主要成分，反映肠道化学屏障功能状况，可促进有益菌的定植并阻止病原菌的黏附[23]。肉鸡饲粮中添加抗菌肽Plectasin可提高回肠中ZO-1和CLDN-3的表达[24]；通过腹腔注射抗菌肽C-BF可显著提高断奶仔猪空肠和结肠中ZO-1、OCLN和CLDN-1的表达，维持肠道上皮细胞屏障的完整性[25]。本研究发现，API添加可上调空肠OCLN和十二指肠MUC2的表达。表明API可上调紧密连接蛋白基因和黏蛋白基因的表达，一定程度抑制病原菌对肠道的黏附，减少由于肠道屏障功能缺陷而导致的肠道健康问题。

肠道是机体最大的免疫器官，肠道免疫屏障中相关淋巴样组织可分泌多种细胞因子，它们能够抑制并杀死病原体进而调节肠道黏膜的免疫功能[26]。断奶仔猪腹腔注射抗菌肽C-BF可显著降低空肠和回肠中IL-6、IL-8、IL-22和IL-10的表达[25]。海兰褐蛋用仔公鸡饲粮中添加天蚕素抗菌肽可显著降低空肠中IL-6、IFN-γ和TNF-α的表达，有效减轻了肠道炎症的发生[27]。本研究中API添加上调了空肠中IL-10的表达，下调了十二指肠和空肠TNF-α和IFN-γ的表达，表明API可通过调节肠道免疫细胞因子的表达增强肠道免疫屏障功能，改善肠道健康。