箬叶抑菌提取物提取工艺优化及抑菌活性

刘立萍 徐 鹏 雷小红 王 宁 杨 兵

箬叶是箬竹植物的叶。中国箬竹约有20种以上，主要分布在长江以南地区[1]，其中阔叶箬竹分布最广，民间使用也最广泛[2]。研究[3-4]表明，箬叶具有一定的防腐抑菌功效，是很好的植物源天然防腐抑菌剂来源。

截至目前，国内外对箬叶的研究主要关注其营养物质和元素含量[5-7]，以及挥发油[8]、总黄酮[9-11]、多糖[12]等活性物质的提取、分离与测试，其提取物中黄酮类、多糖、生物碱等均具有较好的抑菌杀菌作用[9]。李俊超等[13]研究发现箬竹叶的提取物对烟草病原真菌链格孢菌和烟草疫霉菌菌丝生长均具有抑制效果。孙克奎[12]研究发现，箬叶多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的抑制效果，对地衣芽孢杆菌也有较明显的抑制效果。乐薇等[14]和吉瑞冬等[15]研究箬叶总黄酮提取和对细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)、真菌(白色念珠菌、酿酒酵母菌、青霉菌)的抑菌作用，发现箬叶总黄酮对细菌的抑制效果大于对真菌的抑制效果；并且不同提取方法对箬叶总黄酮的抑菌效果有影响，超声波法比较适合于箬叶总黄酮的提取。何舟等[16]研究了箬叶水提取物和乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌活性的影响，发现水提取物比乙醇提取物的抑菌作用强。邓龙兴等[17]用菌丝生长速率法比较研究了箬竹叶粗提物及其萃取相对深绿木霉和烟草链格孢菌生长率的影响，发现正丁醇相对深绿木霉的抗菌活性最高，乙酸乙酯相对烟草链格孢菌的抗菌活性最高。Sun等[18-19]用95%乙醇对箬叶抗菌成分进行提取和分离，发现有两种竹叶提取物具有良好的清除自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒、增强免疫力等生物功效；同时也对分离得到的化合物进行了体外抗菌活性试验，发现芹菜素6-C-α-L-阿拉伯吡喃糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)和芹菜素7-O，8-C-二吡喃葡萄糖苷(6)对4株细菌(金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和青枯假单胞菌)均有抑菌活性。这些研究对箬叶提取物抑菌活性和提取方法都比较局限，抑菌试验方法均为滤纸片法，指示菌未涵盖铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌。研究拟以常见致病菌(痢疾志贺氏菌和沙门氏菌)和腐败菌(枯草杆菌和铜绿假单胞菌)为试验菌，选择阔叶箬竹叶为试验材料，研究提取物的抑菌效果，探明箬叶中抑菌成分最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

阔叶箬竹的叶：2021年4月15日采自怀化市洪江区；

枯草芽孢杆菌[Bacillussubtilis，CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌[Pseudomonasaeruginoda(Schroeter)Migula，ATCC9027-1]、痢疾志贺氏菌[Shigelladysenteriae，CMCC(B)51252]和伤寒沙门氏菌[S.typhi，CMCC(B)50071]：-80 ℃保存，中国医学细菌保藏管理中心；

抗生素检定培养基Ⅱ号(高)：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；

庆大霉素国家药品标准物质：批号130326-201716，中国食品药品检定研究院；

乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

盐酸、氨水：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；

冰醋酸：分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

乙酸乙酯：色谱纯，天津化学试剂研究所。

1.2 主要仪器与设备

中药材高速粉碎机：FD-15-T250A型，上海市闵行区舰艇工贸有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52AA型，上海雅荣生化仪器设备有限公司；

立式灭菌器：LMQ.C-80E型，山东新华医疗器械股份有限公司；

Ⅱ级A2生物安全柜：1374型，赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司；

超低温冰箱：DW-HL388型，中科美菱低温科技股份有限公司；

生化培养箱：SPX-150型，上海金慧科电子有限公司；

超声清洗机：9960B型，天津科贝尔光电技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 对照品标准系列制备 按文献[20]的方法配制0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL标准系列溶液，用于抑菌试验参比。

1.3.2 试验菌种复壮和菌悬液制备 按文献[20]的方法复壮试验菌，制备约1×107CFU/mL的菌悬液用于抑菌试验。

1.3.3 试验菌平板的制作 在试验中，微生物平板表层均匀平铺了试验菌的称为试验菌平板，平板表层为菌层培养基，下层为底层培养基。

取抗生素检定培养基Ⅱ号(高pH) 100 mL于200 mL无菌广口瓶，置于(46±1) ℃水浴，依次接入1 mL菌悬液，混匀，趁热取5 mL，迅速平铺到底层培养基平板，冷却凝固，即得4种不同试验菌平板，供提取物抑菌试验使用。

1.3.4 箬叶处理 鲜叶洗净，50～55 ℃烘干，粉碎，过42目筛，密封。

1.3.5 提取物制备

(1) 不同溶剂提取物：分别称取9份箬叶粉未10 g于250 mL三角瓶中，依次加入100 mL水、乙酸乙酯、盐酸溶液(pH 4)、乙酸水溶液(pH 4)、氨水溶液(pH 10)、30%(体积分数)乙醇、60%(体积分数)乙醇、80%(体积分数)乙醇和95%(体积分数)乙醇9种提取溶剂，浸泡24 h，再超声2次，超声条件为温度45 ℃，时间30 min，2次提取液合并，然后旋转蒸发(水浴50 ℃)，减压浓缩至10 mL，每毫升提取液相当于1 g干样。

(2) 不同方法提取物：选择水、60%(体积分数)乙醇、盐酸水溶液(pH 4)、氨水溶液(pH 10) 4种代表性提取溶剂，称取12份箬叶粉未，每份10 g，分成4组，每种溶剂按液固比10∶1 (mL/g)，分别用超声辅助法(40 kHz，400 W，45 ℃，30 min)、回流法(60%乙醇回流温度80 ℃，其他100 ℃)和浸提法(室温，24 h) 3种方法进行提取，提取2次，合并滤液，旋转蒸发(水浴50 ℃)，减压浓缩至10 mL。

1.3.6 抑菌试验 以枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌4种试验菌为指示菌，总抑菌圈大小为评价指标，庆大霉素标准系列为对照，参照文献[21]，用牛津杯法开展抑菌试验。按1.3.3方法制备试验菌平板，在平板中均匀放置4个无菌牛津杯，在牛津杯中加入0.280 mL试液，试液不得溢出，做两平行，同时做空白试验，36.5 ℃培养15～16 h，测定抑菌圈直径，评价抑菌效果。

1.3.7 单因素试验 用水作提取溶剂，选择超声条件为频率40 kHz、功率400 W、温度45 ℃下，单因素为液固比、超声次数和超声时间。固定超声时间和超声次数，研究液固比对提取物抑菌效果的影响；固定液固比和超声次数，研究料超声时间对提取物抑菌效果的影响；固定液固比和超声时间，研究超声次数对提取物抑菌效果的影响。试验重复2次。

1.3.8 最佳提取工艺参数选择试验 通过单因素试验结果分析，选择3个合适的因素水平，按L9(33)正交试验，提取箬叶抑菌提取物，制成含生药1 g/mL的试液，按1.3.6方法用各提取物做抑菌试验，量取抑菌圈直径，比较抑菌效果，找到最佳提取工艺参数，获取最佳提取物。

1.3.9 最佳抑菌提取物与对照品标准系列抑菌效果的比较 在最佳提取工艺条件下，提取箬叶提取物进行抑菌试验，试验重复5次，计算其变动范围，用平均值与庆大霉素标准系列的抑菌效果作比较。

2 结果与分析

2.1 箬叶抑菌提取物提取溶剂和提取方法的筛选

2.1.1 不同提取溶剂箬叶提取物的抑菌情况 用1.3.6抑菌试验方法，对1.3.5中不同提取溶剂所获提取物开展抑菌试验，结果见表1和表2。

表1 不同提取溶剂箬叶提取物的抑菌情况(抑菌圈直径)†Table 1 Bacteriostasis of extract from Indocalamus leaves with different solvents (diameter of bacteriostatic circle) mm

表2 箬叶不同体积分数乙醇提取物的抑菌情况(抑菌圈直径)Table 2 Bacteriostasis of different concentrations ethanol extracts from Indocalamus leaves (diameter of bacteriostatic circle) mm

表1和表2结果显示，箬叶乙醇提取物的抑菌效果整体较弱，乙酸溶液(pH 4)提取物抑菌效果最好，为81.5 mm,水提取物为66.1 mm，乙酸乙酯提取物为65.4 mm；但是乙酸溶液(pH 4)空白为73.2 mm，乙酸乙酯的空白为34.2 mm，水的空白无抑菌效果，可见，水是最好的提取溶剂。

2.1.2 不同提取方法箬叶提取物的抑菌情况 用水、60%乙醇、pH 4乙酸溶液、pH 10氨水溶液4种代表性提取溶剂分别采用超声辅助法、回流法和浸提法3种方法进行提取，所获提取物的抑菌效果见表3，庆大霉素标准系列的抑菌作用见表4。

由表3可知，水超声提取物的抑菌效果最好，超声法是最好的提取方法。

由表4可知，庆大霉素对4种指示菌抑菌作用显著，标准系列的抑菌效果曲线方程相关系数均大于0.95，说明在选定的浓度范围内，其对各试验菌的抑菌效果与浓度呈正相关性。

表1和表2结果表明，水提取物抑菌性能优于乙醇提取物，与文献[16]的研究结果一致，虽然指示菌不同，但同样说明箬叶中水溶性抑菌物质比醇溶性抑菌物质效果好。箬叶中含有丰富的生物活性成分[19]，其中黄酮类、多糖、生物碱等都有着较强的抑菌杀菌作用[17]。生物活性成分化学结构不同，极性会有差异，在水中的溶解性也会有差异。黄酮类既有溶于水的，也有溶于醇的；多糖类溶于水，但不是真溶液；萜类物质极性中等偏小，微溶于水，易溶于醇，但萜苷类易溶于水；酚酸类为水溶性物质；生物碱大部分不溶于水，易溶于醇，但由生物碱生成的盐极易溶于水。箬叶水提取物抑菌活性优于乙醇提取物，可能因为箬叶中含有多种强极性水溶性活性物质或者其他活性成分，含中等偏小极性的活性成分相对较少，有待进一步对箬叶水提取物化学成分及其单体开展含量测定和抑菌活性研究。

2.2 提取抑菌活性物单因素试验

2.2.1 液固比对箬叶提取物抑菌效果的影响 固定超声时间30 min和超声次数1次，选择液固比分别为4∶1，8∶1，10∶1，12∶1，16∶1，20∶1 (mL/g)，提取物抑菌效果见图1。

由图1可知，随着液固比的增加，提取物的抑菌活性迅速增强，当液固比增加到12∶1 (mL/g)后，提取物抑菌活性增强缓慢，因为随着提取溶剂用量的增加，抑菌物质提取率随之增加，液固比为12∶1 (mL/g)后，活性物质大部分已扩散到提取溶剂中，再增加提取溶剂用量，提取物抑菌活性增强缓慢。因此，12∶1 (mL/g)是比较适宜的液固比。

表3 3种提取方法箬叶提取物的抑菌情况(抑菌圈直径)Table 3 Bacteriostasis of the extracts from Indocalamus leaves by three extraction methods (diameter of bacteriostatic circle) mm

表4 庆大霉素对照品标准系列对4种指示菌的抑菌作用(抑菌圈直径)Table 4 Bacteriostatic effects of gentamicin standard series on 4 indicator bacteria (diameter of bacteriostatic circle)

图1 液固比对箬叶提取物抑菌效果的影响Figure 1 Effects of liquid-to-material ratio on bacteriostasis of Indocalamus leaves extract

2.2.2 超声时间对箬叶提取物抑菌效果的影响 固定液固比10∶1 (mL/g)和超声次数1次，选择超声时间分别为15，25，35，45，55，65 min，提取物抑菌效果见图2。

图2 超声时间对箬叶提取物抑菌效果的影响Figure 2 Effects of ultrasonic time on bacteriostasis of Indocalamus leaves extract

由图2可知，总体上随着超声时间的延长，提取物抑菌活性增强，当超声时间增加到45 min后，提取物抑菌活性趋于平稳，说明随着超声时间的延长，细胞内抑菌物质逐渐溶出。从45 min增加到55 min，提取物对痢疾志贺氏菌和铜绿假单胞菌活性有所下降，可能由于受热时间延长，个别成分变化所致；也可能是试验误差所致。从15 min增加到25 min，提取物对痢疾志贺氏菌活性有所下降，因试验误差所致。所以，提取时间选择45 min左右比较合适。

2.2.3 超声次数对箬叶提取物抑菌效果的影响 固定液固比10∶1 (mL/g)和超声时间30 min，选择超声次数分别为1，2，3，4，5，6次，提取物抑菌效果见图3。

由图3可知，总体上随着超声次数的增加，提取物的抑菌活性不断增强，当超声次数增加到3次后，提取物抑菌活性趋于平稳，说明此时抑菌物质提取比较充分。但提取物对痢疾志贺氏菌和铜绿假单胞菌活性有所下降，超声次数增加到5，提取物对伤寒沙门氏菌的活性才有所下降，可能由于超声次数增加，受热时间也增加，个别成分被破坏所致，也可能是试验误差所至。为节约能源，选择超声3次比较理想。

图3 超声次数对箬叶提取物抑菌效果的影响Figure 3 Effects of ultrasonic number of times on bacteriostasis of Indocalamus leaves extract

2.3 最佳提取工艺参数

以水为提取溶剂，选择表5的因素和水平，按照 L9(33) 开展正交试验，制备箬叶提取物，用1.3.6方法开展抑菌试验，分析各条件下所获提取物的抑菌效果，结果分析见表6和表7。

由表6可知，影响抑菌物质提取效果因素的主次顺序为超声次数>料液比>超声时间，最佳提取工艺为固液比16∶1 (mL/g)，超声次数4次，超声时间55 min。由表7可知，超声次数是重要的影响因素。

2.4 最佳提取物与对照品标准系列的抑菌情况比较

按最佳工艺参数，提取箬叶中最佳提取物，用1.3.6方法进行抑菌试验，共试验5次，同时与对照品标准系列抑菌效果进行比较，结果见表8。

表8结果显示，最佳提取物对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径分别为(16.9±1.54)，(23.8±1.80)，(22.3±1.41)，(17.9±1.13) mm，平均总抑菌圈为80.9 mm，平均抑菌效果相当于0.01，>0.05，>0.05，0.03 mg/mL庆大霉素，说明对4种试验菌的抑菌效果显著，可作为食品添加剂、化妆品和日用化工原料进行开发和利用，同时，比较表6，参数A3B2C1条件下的总抑菌圈与此结果相差不大。

表5 正交试验的因素和水平Table 5 Factors and levels of the orthogonal test

表6 正交试验设计及结果Table 6 Orthogonal experimental design and results

表7 正交试验方差分析Table 7 Results of variance analysis of orthogonal test

表8 最佳提取物抑菌试验结果统计Table 8 Statistical analysis of the results of bacteriostatic test of the best extract (n=5)

3 结论

箬叶抑菌物最佳提取工艺条件为：以水为提取溶剂，采用超声辅助提取方法，提取参数为液固比16∶1 (mL/g)，超声4次，时间55 min。该工艺条件简单易行，环境友好，无污染；所获取的提取物对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌两种典型腐败菌，伤寒沙门氏菌和痢疾志贺氏菌两种常见致病菌的抑菌效果显著；从节约能源和提高工作效率考虑，建议实际工作中使用工艺参数液固比16∶1 (mL/g)，超声3次，时间35 min。另外，目前对箬叶水提物的研究严重不足，应加强其中未知抑菌成分分析，开展广普抑菌试验，多方面开展活性稳定性研究，开发更多相关产品。