原发性肝癌组织中溴结构域蛋白4的表达及与临床病理特征和预后的关系*

戴婷丽，张梦岚，高红玲，刘显妮，陈海雯，李筱玥，郭燕

（青海省人民医院 病理科，青海 西宁 810000）

肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一[1]，手术切除仍是目前根治原发性肝癌（primary hepatic carcinoma,PHC）的首选方法[2]。随着医疗技术不断发展，越来越多的PHC 患者被早期发现，行手术治疗的患者不断增多，但术后高复发率仍是困扰临床医师的棘手问题[3]。近期研究显示，溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4,BRD4）等因子参与肝癌[4]、宫颈癌[5]、卵巢癌[6]等多种癌症的发生、发展，与肿瘤细胞的生长、迁移、浸润关系密切。目前国内回顾性研究显示，抑制BRD4 表达可抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡[7]。但是关于PHC 癌组织中BRD4 蛋白表达与PHC 患者临床病理特征、预后的关系，以及关系验证的前瞻性研究尚未见报道。因此，本研究将83 例PHC 患者纳入研究，通过前瞻性研究探讨上述问题，为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年7月—2018年7月青海省人民医院收治的PHC 患者83 例作为研究对象。其中，男性49 例，女性34 例；年龄22～75 岁，平均（53.26±6.97）岁。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 纳入、排除及剔除标准

1.2.1 纳入标准①符合《原发性肝癌的分层筛查与监测指南（2020 版）》[8]PHC 诊断标准；②首次行PHC 根治术；③既往未接受任何形式治疗；④Child-Pugh 肝功 能 分 级为A 级、B 级；⑤年龄＞18 岁。

1.2.2 排除标准①合并其他部位恶性肿瘤；②重要脏器严重功能障碍；③伴有免疫缺陷性疾病、传染性疾病、血液系统疾病、全身系统性疾病；④伴有精神性疾病、认知功能障碍；⑤根治性手术前发现远处转移；⑥有药物滥用史、吸毒史及妊娠或哺乳期女性；⑥伴有代谢性脑病、颅内器质性病变、严重心脑血管疾病；⑦有手术禁忌证。

1.2.3 剔除标准①治疗过程中死亡；②自行终止治疗；③依从性差；④自然失访。

1.3 方法

1.3.1 取材方法患者均行PHC 根治手术切取病灶，取距肿瘤组织5～9 mm 的组织作为癌旁组织，并行术中快速病理检查，确保每位患者切除组织包含癌组织和癌旁组织。

1.3.2 PHC 手术切除标准①完整切除肉眼可见的肝静脉、门静脉、胆管、下腔静脉癌栓；②无门静脉主干及一级分支、肝静脉主干及邻近脏器侵犯，无肝门淋巴结、肝外转移；③切除肿瘤的边界距离肝脏＞1 cm，肝断面组织学检查无肿瘤细胞残留（切缘阴性）；④PHC 根治手术后2 个月行超声、CT、MRI（≥2 项检查）检查未见肿瘤残留病灶，术前甲胎蛋白（alpha-fetal protein,AFP）升高者术后2 个月内AFP 降至正常范围[9]。

1.3.3 免疫组织化学法检测BRD4 的表达取癌组织和癌旁组织标本用石蜡包埋、切片，灭活、微波抗原修复、洗涤，添加BRD4 一抗（美国Abcam公司），4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）冲洗，分别滴入二抗、二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）显色液（四川海诺威科技有限公司），苏木精复染、脱水、封片。染色程度为无色、淡棕色、棕色、棕褐色，染色范围＜5%、5%～＜25%、25%～＜75%、≥75%，分别计为0 分、1 分、2 分、3 分，计算染色程度与染 色 范围评分的乘积，结果0 分为阴性表达，否则为阳性表达。

1.3.4 预后随访所有患者术后采用门诊复查、电话等方式随访3年，术后第1年，每3 个月复查1 次；自预防性经导管动脉栓塞化疗（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）术后第2年起，每6 个月复查1 次。诊断为复发的患者根据个体情况选择TACE（无远处转移、见肝内复发转移者，微血管侵犯，切缘复发肝动脉末梢增多且呈团块状或串珠状肿瘤染色）、保守治疗等治疗方式（≥2 种影像学检查手段发现肝癌典型“快进快出”特征为复发）。统计随访期间无病生存率、总生存率，出现癌因死亡者则终止随访。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比或率表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验；影响因素的分析用Cox 比例风险模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者癌组织、癌旁组织中BRD4的表达

83 例PHC 患者中，癌组织中BRD4 阳性表达52 例（62.65%），癌旁组织中BRD4 阳性表达9 例（10.84%），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=47.921，P=0.000）。

2.2 癌组织中BRD4蛋白阳性表达与PHC患者临床病理特征的关系

不同性别、年龄、总胆红素、肿瘤数目、病理类型、乙型肝炎病毒感染、AFP、肝硬化、Child-Pugh 肝功能分级、肿瘤直径患者癌组织中BRD4 蛋白阳性表达率比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同微血管侵犯、肿瘤包膜、临床分期、分化程度患者癌组织中BRD4 蛋白阳性表达率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），有微血管侵犯、肿瘤包膜不完整、临床分期Ⅲ期、低分化患者癌组织中BRD4 蛋白阳性表达率较高。见表1。

表1 不同因素PHC患者BRD4蛋白阳性表达率比较 例（%）

续表1

2.3 影响PHC患者预后的因素

83 例PHC 患者截止随访结束共8 例失访，其中52 例BRD4 蛋白阳性表达患者失访7 例，31 例阴性患者失访1 例。剩余75 例患者中36 例（48.00%）无病生存，51 例（68.00%）生存。

单因素Cox 回归分析结果显示，微血管侵犯、肿瘤包膜、临床分期、分化程度、BRD4 蛋白表达是PHC 患者复发的影响因素（P＜0.05）（见表2）。多因素Cox 回归分析结果显示，微血管侵犯[=5.379（95% CI：3.487，13.005）]、肿瘤包膜[=5.614（95% CI：3.986，16.115）]、临床分期[=5.312（95% CI：3.307，12.413）]、分化程度[=4.187（95% CI：2.893，10.006）]、BRD4 蛋白表达[=5.799（95% CI：4.156，17.235）]是PHC 患者复发的独立影响因素（P＜0.05）（见表3）。

表2 PHC患者复发的单因素Cox回归分析参数

表3 PHC患者复发的多因素Cox回归分析参数

单因素Cox 回归分析结果显示，微血管侵犯、肿瘤包膜、临床分期、分化程度、BRD4蛋白表达是PHC 患者生存的影响因素（P＜0.05）（见表4）。多因素Cox 回归分析结果显示，肿瘤包膜[=3.152（95% CI：2.150，8.795）]、临床分期[=4.998（95% CI：2.695，11.003）]、分化程度[=5.650 （95% CI：3.803，17.001）]、BRD4 蛋白表达[=5.987（95% CI：4.384，18.828）]是PHC 患者生存的独立影响因素（P＜0.05）（见表5）。

表4 PHC患者生存的单因素Cox回归分析参数

表5 PHC患者生存的多因素Cox回归分析参数

2.4 癌组织中BRD4蛋白表达与PHC患者预后的关系

截止随访结束，75 例患者中36 例（48.00%）无病生存，其中45 例BRD4 蛋白阳性表达患者无病生存14 例，30 例BRD4 蛋白阴性表达患者无病生存22 例；45 例BRD4 蛋白阳性患者存活24 例，30 例BRD4 蛋白阴性表达患者存活27 例；BRD4 蛋白阳性表达患者与阴性表达患者的无病生存率、总生存率比较，差异均有统计学意义（χ2=11.858 和10.914，均P=0.001），BRD4 蛋白阴性表达患者的无病生存率、总生存率高于BRD4 蛋白阳性表达患者。见图1、2。

图1 PHC组织中BRD4蛋白阴性表达和阳性表达患者的无病生存曲线

图2 PHC组织中BRD4蛋白阴性表达和阳性表达患者的总生存曲线

3 讨论

肿瘤细胞增殖情况可有效反映肿瘤生物学特性，与PHC手术疗效密切相关。BRD4是溴结构域及末端蛋白家族的成员，参与调控DNA复制、染色质重塑、转录等多个生物学过程[10-11]。BRD4 可抑制超级增强子与目标启动子之间的作用，对癌基因及细胞凋亡有特异性抑制作用。BRD4的表达变化可有效反映正常组织、癌组织增殖活性，对肿瘤复发、转移有重要作用[12-13]。

本研究结果表明，癌组织中BRD4 蛋白阳性表达率高于癌旁组织，有微血管侵犯、肿瘤包膜不完整、临床分期Ⅲ期、低分化患者癌组织BRD4 蛋白阳性表达率较高，提示PHC 患者癌组织中BRD4 蛋白阳性率较高，BRD4与PHC患者临床病理特征有关。BRD是一组含有110 个氨基酸的蛋白模块，可通过不寻常的左手四螺旋束结构来识别组蛋白乙酰化赖氨酸。BRD4属于转录及表观遗传调节因子之一，在癌症进展过程中发挥关键作用。BRD4具有2个串联溴结构域，可选择性识别组蛋白中乙酰化赖氨酸的保守蛋白结构域，与染色质中的乙酰化赖氨酸结合，使染色质重塑因子、转录因子等相关蛋白募集到特定基因转录位点，从而调控下游靶基因的表达，参与细胞恶化及癌细胞增殖、分化、侵袭、转移等生理过程[14-15]。BRD4可与性转录延伸因子b 复合体等蛋白质复合体相互作用，并刺激RNA聚合酶Ⅱ型转录。在有丝分裂过程中，BRD4 与染色体结合，活化或抑制细胞靶基因，抑制BRD4活性可抑制肿瘤细胞生长、增殖等过程。笔者认为BRD4 还可招募其他转录因子至染色体，促使癌基因激活，抑制抑癌基因表达，促进PHC发生、肿瘤细胞增殖等，但相关具体的抑癌基因尚不清楚，下一步研究将重点探讨。

本研究中多因素Cox 回归分析结果显示，微血管侵犯、肿瘤包膜、临床分期、分化程度、BRD4蛋白表达是PHC 患者复发的独立影响因素；肿瘤包膜、临床分期、分化程度、BRD4蛋白表达是PHC患者生存的独立影响因素，再次提示PHC 组织中BRD4 蛋白表达是患者预后的影响因素。癌组织中BRD4蛋白阴性表达患者的无病生存率、总生存率高于BRD4 蛋白阳性表达者，再次印证PHC 组织中BRD4 蛋白表达与患者预后有关，PHC 患者癌组织中BRD4 蛋白阳性表达可增大术后复发风险，减少总生存获益。

综上所述，PHC 患者癌组织中BRD4 蛋白表达与临床病理特征及预后有关，BRD4 蛋白阳性表达者预后不良风险高。本研究仍存在不足之处，样本量较小，未进一步统计BRD4 蛋白阳性率高、低表达者临床病理特征及预后情况，后期将针对不足之处开展多中心、大样本量实验进一步完善研究。