大米和玉米比例对鲊广椒品质及细菌类群的影响

席啦，熊英梅，王玉荣，侯强川，王婷，杨莹，郭壮*

1(湖北文理学院,湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北 襄阳，441053)2(湖北文理学院,乳酸菌生物技术与工程襄阳市重点 实验室，湖北 襄阳，441053)3(襄阳市公共检验检测中心，湖北 襄阳，441001)

作为我国地方特色发酵食品，鲊广椒主要以二荆条辣椒和大米粉或玉米粉为原料，经剁碎和搅拌均匀后装坛密封发酵而成[1]，因其特殊的发酵原料、酸辣的口感和特殊的香味受到广大消费者的欢迎[2]。在我国贵州等少数民族聚集区的居民食用的鲊广椒常以玉米为原料进行发酵[3-4]，而在湖北荆州等地区常使用大米作为发酵基质进行鲊广椒的制作。本研究团队对鲊广椒中微生物多样性进行了解析[5]，发现真菌含量过高不利于鲊广椒滋味品质的形成[6]，但乳酸菌对于鲊广椒风味和滋味品质的塑造具有重要的作用[7]；崔梦君等[8]亦发现不同的发酵工艺和辣椒会影响莽椒的品质和发酵菌群。因此，不同的原料不仅可以赋予鲊广椒不同的风味，还可能对其微生物多样性产生影响[4]，探究不同原料对鲊广椒品质和菌群的影响是十分必要的。

感官品鉴被广泛地应用于食品品质的评价，但其太过于依赖品鉴人员的专业技能，且容易受到主观因素的影响[9]。随着仿生设备的发展，电子舌和电子鼻等仿生学设备被广泛的应用于传统发酵食品滋味和风味的评价[10-11]，两者对于食品的品质具有整体选择性，在食品品质评价方面具有较大的优势[12-13]。研究人员对发酵食品中微生物进行解析的目的之一是探讨微生物对食品品质的影响，进而寻求提升发酵食品品质的途径。而随着高通量技术的迅速发展，以Illumina为代表的第二代测序技术在解析传统发酵食品中扮演着重要的角色，这也为本研究探究鲊广椒中微生物多样性提供了有效的手段。

本研究分别以不同配比的大米和玉米为原料进行了鲊广椒制备，同时使用电子舌和电子鼻技术对不同鲊广椒的品质进行了评价，并结合高通量测序技术对其蕴含微生物群落结构进行了解析，以此探究添加玉米对鲊广椒整体品质的影响，以期对鲊广椒制作工艺的改良提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米，湖北京和米业有限公司；玉米，赣州市九鲤湖食品有限公司；二荆条辣椒及各种调味料，市售；食盐，沧州盐业集团银山食盐有限公司。

阳离子溶液、阴离子溶液、预处理溶液、参比溶液、内部溶液，日本INSENT公司；引物338F/806R，武汉天一辉远生物科技有限公司合成；10×PCR buffer、FastPfu Fly DNA聚合酶和dNTPs Mix，北京全式金生物技术有限公司；DNA基因组提取试剂盒，德国QIAGEN公司。

1.2 仪器与设备

LRH-70F生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；CR21 N高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；SA 402B电子舌，日本Insent公司；PEN3电子鼻，德国Airsense公司；vetiri梯度基因扩增仪，美国AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度计，美国Nano Drop公司；Fluor Chem FC3型化学发光凝胶成像系统，美国ProteinSimple公司；Illumina MiSeq高通量测序平台，美国Illumina公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鲊广椒的制备

设置5个试验组，其中A1组均为大米粉，A5组均为玉米粉，A2、A3和A4组大米粉和玉米粉的质量比分别为3∶1、1∶1和1∶3，每组大米粉和玉米粉的总质量均为800 g。称取40 g食盐、3.20 g白胡椒、3.20 g花椒和225 g剁碎后的二荆条辣椒各5份，分别添加至A1～A5中搅拌均匀后装入坛中进行密封发酵，并在坛口喷洒白酒进行杀菌，封口后置于30 ℃恒温发酵30 d。

1.3.2 鲊广椒滋味品质的测定

准确称取鲊广椒50 g和量取150 mL蒸馏水，混合搅拌均匀后进行抽滤，取上清液10 000 r/min离心8 min后装入烧杯中置于4 ℃冰箱中静置24 h，吸取上清液储存于测试杯中备用。参照杨成聪等[14]关于苏打水滋味指标的测试参数进行设置，使用电子舌对鲊广椒的酸、苦、涩、咸和鲜等5个基本味和后味A、后味B和丰度等3个基本味回味进行数字化测定，每份鲊广椒平行测定4次，取后3次作为本实验测试数据进行后续分析。

1.3.3 鲊广椒风味品质的测定

准确称取20 g鲊广椒置于电子鼻专用样品瓶中盖上盖帽进行密封。将样品瓶置于50 ℃水浴锅中保温30 min后于室温静置30 min，进行鲊广椒风味品质的数字化测定。参照张逸舒等[15]的方法进行测试参数设置，对鲊广椒的10个特征型风味物质进行测定，每个样本平行测定3次，每次测试时间为90 s，所有样本在50 s后均达到平台期，本研究选取59、60、61 s时响应值的平均值作为样本的测试数据用于后续分析。

1.3.4 鲊广椒微生物宏基因组DNA提取及测序

称取1.0 g左右的鲊广椒，使用试剂盒进行微生物宏基因组DNA的提取。参照崔梦君等[8]的方法进行PCR扩增参数的设置，并对检验合格的DNA进行扩增。使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对扩增DNA产物的浓度和纯度进行检验，并将检验合格的DNA产物送至上海美吉生物医药有限公司进行测序。

1.3.5 生物信息学分析

依照崔梦君等[8]参数进行序列的质量控制，并根据Barcode标签信息对下机序列进行分配，将序列归并到不同的样本中。本研究以QIIME v1.70平台为依托，并结合个性化分析流程对鲊广椒中细菌构成和多样性进行解析，具体分析流程参照YANG等[16]对奶酪中细菌多样性的研究。

1.3.6 多元统计学分析

本研究基于多元统计学分析对鲊广椒中风味指标的变异系数进行计算；基于R软件采用斯皮尔曼相关性分析对品质指标和优势菌属与原料之间的相关性进行了分析；基于R软件进行了冗余分析。使用R和Origin 2017b进行数据的可视化。

2 结果与分析

2.1 基于电子舌和电子鼻不同原料配比鲊广椒品质的分析

本研究首先使用电子舌和电子鼻对不同原料配比鲊广椒的滋味和风味品质进行数字化评价，并对数据矩阵进行了统计分析。不同原料配比鲊广椒中各滋味指标相对强度的变化趋势如图1所示。

a-酸、苦、咸、鲜味指标；b-涩味、后味A、后味B、丰度指标图1 不同鲊广椒中滋味指标的相对强度Fig.1 The relative intensity of the taste indexes in different Zha-Chili注：A1、A2、A3、A4和A5分别代表大米、m(大米)∶m(玉米)=3∶1、 m(大米)∶m(玉米)=1∶1、m(大米)∶m(玉米)=1∶3和玉米制作 的鲊广椒(下同)

由图1可知，在鲊广椒制作中添加不同比例的玉米作为原材料会对鲊广椒的滋味品质造成较大的影响，其中酸味、苦味和咸味等受到的影响较大(相对强度的极差值均>1)，且以酸味受到的影响最大(相对强度的极差值为3.25)。值得注意的是，随着发酵基质中玉米的比例的提高，鲊广椒酸味的强度不断增加，而苦味和咸味则没有这样的趋势。相关报道显示，当滋味指标的相对强度>1时，消费者便可以通过感官予以识别。由此说明，在发酵基质中添加一定比例的玉米时，会直接影响消费者在食用鲊广椒时的口感。进一步对鲊广椒的风味品质进行分析，鲊广椒风味指标的相对强度如表1所示。

表1 不同鲊广椒中风味指标的相对强度表Table 1 The relative intensity table of different flavor indexes in Zha-Chili

由表1可知，在鲊广椒的发酵基质中添加一定比例的玉米亦会直接影响其风味品质，其中W1C、W5S、W1S和W2S等风味指标在组内存在较大的差异(变异系数>20%)。且玉米的添加能明显增加鲊广椒中芳香类风味物质的含量，并降低鲊广椒中氮氧化合物、甲烷和乙醇的含量。

2.2 鲊广椒中序列丰富度和多样性分析

在使用仿生设备对鲊广椒的品质进行评价的基础上，进一步使用高通量测序技术对鲊广椒中微生物多样性进行了解析，从而探究添加玉米对鲊广椒菌群结构的影响。本研究以测序量为自变量，以发现物种数和香农指数为因变量进行稀疏曲线和香农曲线的绘制，结果如图2所示。

由图2可知，随着测序量的增加，发现物种数呈现上升趋势但并没有达到平台期，而香农曲线已基本达到平衡状态，说明随着测序量的增加可能会有少量新的物种被发现，但在此测序量下，鲊广椒中的微生物多样性已得到充分的解析，说明本研究的测序水平能够满足后续分析分子生物学分析的要求。进一步对添加玉米的比例和菌群多样性的关系进行了分析，α多样性指数随玉米添加量变化的曲线如图3所示。

a-稀疏曲线；b-香农曲线图2 稀疏曲线和香农曲线Fig.2 Sparse curve and Shannon curve

图3 不同鲊广椒中微生物的α多样性指数Fig.3 Alpha diversity index of microbes in different Zha-Chili

由图3可知，4种α多样性指数随着发酵基质中玉米比例的增加均呈现规律性的变化。超1指数和发现物种数随着玉米添加量的增加而不断增大，尽管在刚开始有略微的降低，但整体上呈现明显的上升趋势；而香农指数和辛普森指数则随着玉米含量的增加而呈现出不断下降的趋势。超1指数和发现物种数常用来估算样本中微生物的丰度，而香农指数和辛普森指数常用来估算样本中微生物的多样性。由此可见，随着发酵基质中玉米比例的增加，鲊广椒样本中微生物的多样性不断降低，而微生物的丰度不断上升。鲊广椒中优势细菌门和属相对含量的比较分析，如图4所示。

图4 鲊广椒中优势细菌门和属的比较分析Fig.4 Comparative analysis of dominant Phylum and genus in Zha-Chili

由图4可知，鲊广椒中优势细菌门(平均相对含量>0.10%)有4个，分别为Firmicutes(硬壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Actinobacteria(放线菌门)和Cyanobacteria(蓝菌门)，其平均相对含量分别为97.99%、1.18%、0.37%和0.36%；而优势菌属(平均相对含量>0.10%)亦有4个，分别为Lactobacillus(乳杆菌属)、Pseudomonas(假单胞菌属)、Thermoleophilum(栖热嗜狮菌属)和Acinetobacter(不动杆菌属)，平均相对含量分别为97.90%、0.47%、0.36%和0.16%。值得注意的是，高通量测序结果显示在发酵基质中添加玉米并没有改变鲊广椒中优势细菌属的种类，且其优势菌属与以往研究所报道的相一致[5]。

玉米作为世界上一种重要的粮食作物，其广泛的分布于中国、美国和巴西等国家，与传统水稻相比，玉米具有更高的淀粉、糖类和维生素含量，应用前景广阔[17]。本研究亦发现，随着玉米添加量的增加，乳杆菌属的含量不断下降，但其幅度很小，而其他优势菌属呈现小幅度的线性上升。鲊广椒中乳杆菌属为鲊广椒中的绝对优势菌属，占比高达98%，说明乳杆菌属可能对鲊广椒的品质有着较大的影响，其能发酵碳水化合物产生大量的乳酸和挥发性风味物质影响着鲊广椒的品质。而相关报道显示，玉米中富含丰富的淀粉、纤维素和维生素等营养成分[18]，这可能为鲊广椒中低丰度的优势菌属提供了充足的营养成分，最终导致其相对含量的小幅度增加。

2.3 鲊广椒中菌群与品质的相关性分析

为进一步探究玉米对鲊广椒品质指标和菌群结构的影响，本研究对鲊广椒发酵基质中玉米的比例与鲊广椒品质指标和菌群之间的相关性进行了计算，结果如图5所示。

图5 玉米比例与品质指标和菌群结构的相关性分析Fig.5 Correlation analysis of maize proportion with quality index and microbes structure

由图5可知，玉米含量与酸味、苦味、W1C、乳杆菌属、假单胞菌属、栖热嗜狮菌属和不动杆菌属之间呈显著相关性，其中玉米含量与酸味、假单胞菌属、栖热嗜狮菌属和不动杆菌属呈显著正相关，而与苦味和乳杆菌属呈显著负相关。值得注意的是，玉米含量与全部优势菌属之间均存在显著相关关系。本研究使用冗余分析，进一步探讨了菌群与品质之间的联系，其结果如图6所示。

图6 冗余分析Fig.6 Redundancy analysis

由图6可知，A3、A4和A5号样品与酸味和W1C有着良好的赋值相关，而A1号样品与苦味、咸味、W1S、W2S和W5S之间有着良好的赋值相关，因而上述指标是导致不同鲊广椒样本品质总体结构的显著差异的关键指标。且乳杆菌属与苦味和咸味具有较强的一致性，而假单胞菌属、栖热嗜狮菌属和不动杆菌属与酸味和W1C之间具有较强的一致性。

玉米因其自身的影响特性亦赋予了鲊广椒不同滋味品质，尽管随着玉米含量的增加导致鲊广椒中乳杆菌属的相对含量出现了小幅度的下降，但其酸味和芳香味强度却明显加强，这可能是因为玉米自身的糖含量较高[19]，更容易被微生物所利用，并在食盐的催化下强化了其口感而起到提味的作用。相关报道表明，乳杆菌属能代谢发酵基质中糖的糖类物质而改善发酵制品的风味特性[20]，这也解释了为什么鲊广椒中乳杆菌属的相对含量降低了，而酸味和芳香味反而进一步提升。

3 结论

本研究分别以大米和玉米为原料制作了鲊广椒，同时采用电子舌和电子鼻技术对鲊广椒的品质进行了数字化评价，并结合高通量测序技术对鲊广椒中细菌多样性进行了解析。研究表明，在鲊广椒的发酵基质中添加玉米能明显增加鲊广椒样品的酸味和芳香味，而降低苦味、咸味、氮氧化合物、甲烷和乙醇的强度；鲊广椒中主要以乳杆菌属、假单胞菌属、栖热嗜狮菌属和不动杆菌属为主，而鲊广椒中玉米的添加比例与优势菌属和微生物多样性之间有着显著的相关性。综合分析表明，在鲊广椒的发酵基质中添加一定比例的玉米能够使乳杆菌属的相对含量下降，同时可以降低鲊广椒的苦味和咸味，而增加其酸味和芳香味。