角蛋白17对大鼠胰腺纤维化模型的影响

曾晓龙，严 安，严妍妍，高 雅，王小明

(1.皖南医学院 临床医学院，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 肝胆外科,安徽 芜湖 241001)

胰腺癌(pancreatic cancer，PAC)是恶性程度最高、预后最差，同时也是病死率最高的癌症之一[1]。有研究报道，经手术切除及放、化疗等辅助治疗后的PAC患者5年生存率仍低于10%[2]。胰腺纤维化在PAC中发挥重要作用[3]。

角蛋白属于中间丝蛋白的超家族，可分为Ⅰ型酸性蛋白和Ⅱ型碱性蛋白[4]。角蛋白17(kevatin,KRT17)是Ⅰ型角蛋白，包含432个氨基酸，分子量为48 ku[5]。研究表明，KRT17被认为是多种疾病尤其是PAC的诊断和预后标志物[6]。已有研究探讨KRT17在PAC中的作用及其潜在的功能机制，并证实抑制KRT17可能是PAC治疗的新靶标[7]。但KRT17在胰腺纤维化中的作用鲜有报道，本研究通过腹腔内注射二乙基二硫代氨基甲酸盐(Diethyldithiocarbamate，DDC)建立大鼠胰腺纤维化模型,采用注射不同次数DDC溶液的方法，观察各组大鼠胰腺组织中Ⅰ型胶原含量的变化，探讨KRT17在大鼠胰腺纤维化中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择成年健康SD雄性大鼠20只，体质量180～220 g，适应性饲养1周，自由饮水和进食，自然昼夜节律光照。随机分为对照组、模型组，其中模型组又分为4组，每组各4只。本研究方案已获得弋矶山医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 DDC购自上海麦克林生化科技有限公司，KRT17一抗、Ⅰ型胶原一抗购自Affinity公司，β-actin购自上海碧云天生物技术有限公司；HRP标记的小鼠抗兔IgG、二抗兔IgG SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 复制模型 大鼠胰腺纤维化模型参考宋敏敏、苏丽婷等[8-9]采用的造模方法并进行改进，采用腹腔内注射DDC溶液建立大鼠胰腺纤维化模型。实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。将DDC与生理盐水配制成10%的DDC溶液，临用前现配，隔日1次向腹腔内注射DDC溶液，700 mg/kg，连续注射多次。每次给药1 h后，大鼠自由饮水进食。对照组注射同等体积生理盐水。模型各组分别于实验第7、15、22、30天，腹腔内注射麻药并处死大鼠。

1.4 数据采集

1.4.1 标本采集与制备 各组大鼠造模后均采用腹腔麻醉，颈动脉采血，室温静置后离心得到血清。取胰腺组织，一部分使用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，连续行8 μm切片，并对切片行免疫组化测定。另一部分胰腺组织放置于-80℃冰箱，后期进行Western blot测定。

1.4.2 免疫组化法测定胰腺组织中Ⅰ型胶原 将取出的胰腺组织固定在4%多聚甲醛中，常规石蜡包埋，采用轮转式石蜡切片机行8 μm切片。胰腺组织切片脱蜡后，用3%H2O2阻断内源过氧化物酶活性。在枸橼酸缓冲液中微波修复抗原，滴加免疫染色强力通透液，暴露抗原作用靶点。用5%牛血清白蛋白封闭，加入Collagen Ⅰ抗体(1∶200稀释)，4℃下孵育过夜。次日，滴加生物素标记山羊抗兔IgG抗体作为二抗、SABC作为三抗孵育，再用增强型HRP-DAB底物显色试剂染色。光学显微镜下观察胰腺组织中Ⅰ型胶原的表达水平，采用Image-Pro Plus软件分析平均光密度值计算IOD比值。选取部分切片用苏木精复染细胞核，观察细胞核数量变化。

1.4.3 Western blot法测定胰腺组织中KRT17的含量 取各组大鼠胰腺组织，剪碎放入2 mL EP管中，使用含1%PMSF的RIPA裂解缓冲液提取每个样品的总蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白质定量测定。用SDS-PAGE凝胶电泳法分离，浓缩胶80 V恒压30 min，分离胶120 V恒压电泳至溴酚蓝刚到胶板底部。转移至NC膜上，100 V恒压转印90 min，将膜溶于5%脱脂奶粉溶液室温封闭60 min并与KRT17多克隆抗体(1∶1 000稀释)在4℃孵育过夜。用TBST洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记小鼠抗兔IgG(H+L)抗体作为二抗，在4℃孵育90 min，然后使用ECL发光显色。以β-actin作为内参定量。使用Image J软件对所得蛋白条带进行灰度值分析，计算出KRT17蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 实验过程中，大鼠体质量有所变化，对照组增加最明显，其次是模型第7、15、22天组，增加最少的为第30天组。实验1周后，模型组大鼠饮食饮水量低于对照组，皮毛无光泽，活动情况不佳，精神萎靡。实验2周后模型组部分大鼠出现大便稀溏、异味加重等情况。模型第22、30天组死亡大鼠各1只。死亡的大鼠体型消瘦，其中一只眼眶出血。

2.2 胰腺大体标本的改变 对照组大鼠胰腺组织淡黄色偏白，质地柔软有光泽；模型组大鼠胰腺呈灰白色，组织结构萎缩，见图1。

图1 各组大鼠胰腺大体标本(箭头所示)

2.3 病理结果、胰腺组织中Ⅰ型胶原表达水平 光学显微镜下发现对照组大鼠胰腺组织结构清晰，无明显损伤；模型组大鼠胰腺组织结构呈萎缩状，Ⅰ型胶原纤维生成增多，降解减少，并随着模型组造模时间的延长胰腺纤维化程度逐渐加重，免疫组化图片阳性面积增大，经苏木精复染，阳性区域细胞核减少，见图2、3。通过测定胰腺组织免疫组化切片镜下图片的平均光密度值(IOD)(同等拍摄条件)，分析胰腺组织中I型胶原表达水平。第15、22、30天组胰腺组织中I型胶原表达水平均高于对照组(P<0.05)；第22、30天组胰腺组织中I型胶原表达水平均高于第7、15天组(P<0.05)，见表1。

图2 各组大鼠胰腺组织DAB染色(×200)

图3 各组大鼠胰腺组织DAB染色后苏木精复染(×200)

表1 胰腺组织免疫组化切片镜下图片的IOD值

2.4 胰腺组织中白细胞计数、淋巴细胞绝对值、葡萄糖含量 第15、22、30天组胰腺组织中白细胞计数、淋巴细胞绝对值、葡萄糖含量均高于对照组(P<0.05);第22、30天组胰腺组织中白细胞计数、淋巴细胞绝对值、葡萄糖含量高于第7天组(P<0.05);第22天组胰腺组织中葡萄糖含量高于第15天组(P<0.05)；第30天组胰腺组织中白细胞计数、淋巴细胞绝对值、葡萄糖含量高于第15天组(P<0.05)，见表2。

表2 胰腺组织中白细胞计数、淋巴细胞绝对值、葡萄糖含量

2.5 胰腺组织中KRT17蛋白含量 第15、22、30天组/β-actin胰腺组织中KRT17蛋白含量均高于对照组/β-actin(P<0.05);且第22、30天组/β-actin高于第7、15天组/β-actin(P<0.05)，见图4、表3。

图4 各组大鼠胰腺组织中KRT17蛋白的表达水平

表3 胰腺组织中KRT17的相对表达量

3 讨论

研究表明，KRT17的异常表达与细胞增殖和肿瘤发展有关，例如子宫颈癌[10]、胃癌[11]等。研究也证实，KRT17在PAC患者体内异常表达。但是尚未有报道其在胰腺纤维化中的作用表达。有研究发现，慢性胰腺炎的发生与胰腺纤维化关系密切。同时慢性胰腺炎又可持续进展为PAC[12]。

在本研究中，采用腹腔内注射DDC溶液建立大鼠胰腺纤维化模型，本方法克服了之前的尾静脉注射周期短、操作困难等不足并且降低了并发症的发生率及大鼠的病死率。研究结果显示，对照组胰腺组织未见明显病理改变，模型组胰腺组织结构萎缩，炎性细胞浸润，I型胶原沉积，符合胰腺纤维化病理特征，由此可见本实验胰腺纤维化模型制作成功。

除此之外，本项研究的开展，主要是为了更好地了解KRT17在胰腺纤维化中的作用，以便对此破坏性疾病进行干预治疗。研究结果表明，胰腺纤维化程度越高，其组织中的KRT17表达水平越高，其表达水平与胰腺纤维化程度呈正相关，表明高水平的KRT17是导致胰腺纤维化的一个关键因子。

胰腺纤维化与胰腺细胞外基质过度沉积有关，这不仅会导致胰岛素分泌减少，还会引起葡萄糖代谢紊乱[13]。本实验结果表明，随着胰腺纤维化程度的加重，葡萄糖含量亦逐渐升高。

对于慢性胰腺炎，其有着大量的浸润性粒细胞，例如中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，其中粒细胞浸润在慢性胰腺炎的发病机制中至关重要[14]。本研究结果亦表明，随着胰腺纤维化程度的增加，白细胞数亦逐渐增加。这也进一步证明了本实验的正确性。

通过以往研究可知，慢性胰腺炎的病理生理学机制相当复杂，且不完全清楚[15]。其是一种动态炎症过程，特征为进行性纤维化，伴随着疼痛或外分泌和内分泌功能失调[16]。胰腺纤维化是早期慢性胰腺炎的主要可逆性病理变化[17]。慢性胰腺炎的持续发作又可引起PAC的发生[12]。而广泛的纤维化也是PAC发展、生长、转移和抗治疗的基础[18]。本研究提示胰腺纤维化加重程度与KRT17水平上升有关，证实了KRT17在胰腺纤维化形成过程中起着重要作用。我们可以通过进一步研究来抑制纤维化程度的发生、发展，从而推进PAC的治疗进程。

本研究表明，在腹腔注射DDC溶液诱导的大鼠胰腺纤维化模型中，随着胰腺组织纤维化程度的加深，KRT17表达水平升高。我们的研究结果显示，KRT17与胰腺纤维化程度呈正相关关系，可能对胰腺疾病的临床治疗有帮助，并可能用于胰腺纤维化的治疗新靶标。

(本研究得到了皖南医学院第二附属医院肝胆外科陈鹏老师悉心的全程指导，在此特别鸣谢。)