响应面法优化萱草花总黄酮提取工艺研究*

李 盈，杨新惠，马志强，王 琪△

(1．石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832002；2．新疆植物药资源利用教育部重点实验室/石河子大学药学院，新疆 石河子 832002)

百合科萱草属植物萱草(HemerocallisfulvaL.)为民间传统常用的中药，在我国各地均有种植，其根、茎、叶、花，均可用来入药[1]。在民间传统用药中，萱草常被用来安神醒脑、美颜养血、去热解毒、通乳等[2]。近年来，研究发现萱草具有抗肿瘤、抗菌、抗吸血虫病、镇静催眠作用、抗抑郁、肝保护等药理作用[3-5]。萱草花中含有多种生物活性物质包括内酰胺、类胡萝卜素、甾体皂苷、蒽醌、黄酮类等[6]。其中黄酮类化合物具有较好的药理活性[7]。黄红焰等[8]发现萱草黄酮类成分具有显著的降低血糖、抑制脂质过氧化、改善动脉粥样硬化指数的作用。研究表明，萱草花总黄酮对大鼠肝纤维化具有改善作用，对乙醇所致小鼠急性酒精性肝损伤具有明显的保护作用[9-10]。还有研究表明，萱草花总黄铜可以减轻肝纤维化过程中的氧化应激反应，减少氧自由基产生和脂质过氧化物堆积进而缓解肝纤维化，保护肝功能[11]。

研究萱草花中总黄酮提取工艺和分析检测抗氧化成分有利于开发萱草花中总黄酮资源，可提升萱草花经济价值，避免造成资源浪费[12]。目前，国内外对黄酮类化合物提取的方法众多，包括传统的提取方法如浸渍法、煎煮法、回流法、索氏提取法等，以及新方法主要包括超临界流体萃取、超声辅助提取、微波辅助提取、加压液体提取、酶辅助提取等方法[13]。

响应面设计是一种有效的统计和优化方法，与传统的均匀设计与正交设计相比，响应面法具有试验精度高、试验次数少、数学模型预测性好等优点，且能反映各因素与响应值之间的关系[14]。本研究分别运用加热回流法和超声辅助法提取总黄酮，在单因素的基础上，采用响应面法对萱草花总黄酮的提取工艺进行优化，为该种植物的合理利用提供实验理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1一般材料 萱草干燥花2 kg，购于新疆百草堂药业集团；无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)；芦丁对照品(上海融禾医药科技有限公司，批号：081230)；其余化学试剂均为国药集团的分析纯；亚硝酸钠(上海麦克林生化科技有限公司，批号：C11063391)；硝酸铝(上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10792299)；氢氧化钠 (天津市鑫铂特化工有限公司，批号：20200816)。

1.1.2器与试剂 FW-100型高速万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器有限公司)；DZKW-0-2型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；N-1300型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司、东京理化器械株独资工厂)；V-2401PC型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；Sartorius BS110s型万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1对照品溶液配制[15]精密称取2.5 mg干燥至恒重的芦丁对照品，置于25 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解，稀释至刻度，摇匀，混成浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液。

1.2.2待测溶液制备 称取2.5 g萱草花粉末，按照提取条件加热回流，减压浓缩，浓缩液定容至25 mL，作为后续实验的供试品溶液。

1.2.3萱草花类黄酮提取含量的测定

对人性和人的能力的平等主义和乐观主义的看法恰恰也是陆九渊心学的重要思想特征。陆九渊自认为传承的是孟子的思想，孟子就曾说过人皆可以为尧舜，在可以成为圣人这一点上，每个人没有不同，而且都可以成为连孔子都景仰并且自愧不如的最高等的圣人。关于这种乐观主义，陆九渊的表达更多。他十几岁写读书笔记的时候就曾写道“宇宙便是吾心，吾心便是宇宙”[3]，即，我之心、人之心与宇宙是合一的。类似的表达还有“心只是一个心，某之心，吾友之心，上而千百载圣贤之心，下而千百载复有一圣贤，其心亦只如此，心之体甚大”。[3]

1.2.3.1测定波长的选择 精确称取5.34 mg芦丁对照品于25 mL容量瓶中，70%乙醇溶解定容，吸取1.0 mL移入10 mL容量瓶中；加0.4 mL的5% NaNO2溶液，摇匀，静置6 min，再加0.4 mL的10% AL(NO3)3溶液，摇匀，静置6 min，最后加4 mL的4% NaOH溶液，70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置15 min，用紫外-可见分光光度计在200～800 nm内全波长扫描吸收曲线。观察对照品溶液有最大吸收峰的地方，则以此作为测定波长。

1.2.3.2线性关系考察 精密吸取芦丁对照品溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL容量瓶中，每个容量瓶中按照“1.2.3.1”项下方法加入显色剂，以70%乙醇为空白，于最大吸收峰处测定其吸光度A，以芦丁对照品溶液浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，同时得到公式。

供试品溶液按照步骤“1.2.3.1”进行显色反应，测定其吸光度A，结合标准曲线方程，得浓度C，得出相应的黄酮提取量。

1.2.3.3精密度试验 精密吸取芦丁标准液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照步骤“1.2.3.2”测定其吸光度A，重复在同一条件下测定6次，根据吸光度A计算相对标准偏差(RSD)值。

1.2.3.4稳定性试验 吸取总黄酮供试品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，按照步骤“1.2.3.2”分别于0、15、30、45、60、90 min测定吸光值A，计算RSD值。

1.2.3.5重复性试验 吸取6份总黄酮供试品溶液，各取0.5 mL于10 mL容量瓶中，按照步骤“1.2.3.2”测定吸光度A，计算RSD值。

1.2.3.6加样回收率试验 分别精确量取9份已知吸光度的提取液于10 mL容量瓶中，分为3组，依次按照比例每组分别加入浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准品溶液 2.0、3.0、4.0 mL，按标准曲线绘制的显色方法，显色定容，测定吸光度A，计算回收率与RSD值。

1.2.4.1提取溶剂浓度的筛选 精密称取萱草花粉末5份，每份1.0 g，加入 20 mL不同浓度的乙醇(60%、 70%、80%、90%、100%)，每份样品进行1 h的加热回流提取，趁热过滤，减压浓缩，按“1.2.3.2” 项下方法测定总黄酮被提取出的含量。

1.2.4.2提取时间的筛选 精密称取萱草花粉末5份，每份1.0 g，加入20 mL 70%乙醇，分别加热回流提取 30 、60 、90 、120 、150 min，趁热过滤，减压浓缩，按“1.2.3.2”项下方法测定总黄酮被提取出的含量。

1.2.4.3物料比的筛选 精密称取萱草花粉末5份，每份1.0 g，分别按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)的物料比加入70%乙醇，水浴加热回流提取，趁热过滤，减压浓缩，按“1.2.3.2”项下方法测定总黄酮被提取出的含量。

1.2.4.4提取次数的筛选 精密称取萱草花粉末5份，每份1.0 g，分别加入70%乙醇，物料比1∶60(g/mL)，加热回流提取60 min，并且分别提取1、2、3次，趁热过滤，减压浓缩，按“1.2.3.2”项下方法测定总黄酮被提取出的含量。

1.2.5响应面法优化萱草花总黄酮提取条件 根据前期的单因素试验结果，固定提取次数，选取乙醇浓度(A)、提取时间(B)和物料比(C)为自变量，以萱草花总黄酮提取量(Y)为响应值，利用Design-Expert 10软件中的Box-Behnken进行响应面中心组合设计，优化萱草花中总黄酮提取工艺。因素水平及编码见表1。

表1 响应面分析法试验因素水平及编码表

1.3统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行数据处理，采用Design Experet 10.0 软件进行响应面试验。

2 结 果

2.1萱草花类黄酮提取含量测定结果

2.1.1测定波长选择 对照品溶液在510 nm处有最大吸收峰，故选用510 nm为测定波长。

2.1.2线性关系考察 最终确定曲线回归方程为A=15.234C+0.013 1，R2=0.999 1，结果表明芦丁在0.02～0.04 mg/mL线性关系良好。

2.1.3精密度试验 计算出RSD值为 0.852%，表明此试验精密度良好。

2.1.4稳定性试验 计算出RSD值 为 1.571%，表明供试品溶液在1.5 h内稳定。

2.1.5重复性试验 计算出RSD值 为 0.388%，表明此方法重复性符合分析要求。

2.1.6加样回收率试验 平均加样回收率为97.41%，RSD值为1.01%。

2.2单因素试验 通过图1可以明显观察出，当乙醇浓度为90%时，萱草花中总黄酮提取含量最高；如图2所示，以70%乙醇提取，当提取时间为90 min时，总黄酮提取出的含量最高；通过图3可以看出，物料比为1∶60(g/mL)时，总黄酮含量最高；由图4可知，分别提取 1、2、3 次，其中提取2次的总黄酮含量最高。

图1 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响

图2 提取时间对总黄酮提取量的影响

图3 物料比对总黄酮提取量的影响

图4 提取次数对总黄酮提取量的影响

2.3响应面法优化萱草花总黄酮提取工艺结果

2.3.1响应面法实验设计结果 提取次数固定为2次，试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面设计方案与结果

将表2中数据用 Design-Expert 10软件进行多元模拟拟合分析，得到以萱草花中总黄酮提取含量为目标函数的二次回归方程：Y=14.77+0.46A+0.016B-0.31C-0.23AB-0.25AC+0.82BC-1.81A2-0.44B2-1.44C2，方差分析见表3。

2.3.2两两因素交互作用分析 利用响应面曲面图来反映各因素之间的两两交互对萱草花中总黄酮提取含量的影响，通过软件做了3个关键影响因素对萱草花中总黄酮提取含量交互影响的等高线图及其曲面图(图5、6、7)，响应值受曲线走势影响，即越陡的曲线走势，对总黄酮的提取含量影响越大；越平滑的曲线走势，对总黄酮提取含量的影响越小。从等高线图可以直观地反映出两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆形表示两因素交互作用显著。乙醇浓度对总黄酮提取含量的影响较大，因为其曲线趋势较陡；物料比和提取时间对其影响较小，因为其曲线趋势较平缓。

图5 乙醇浓度与提取时间对萱草花总黄酮提取含量的响应曲面及等高线图

2.3.3验证实验 通过Design-Expert 10软件分析计算得出的最佳提取条件为：乙醇浓度90%，提取时间90 min，物料比1∶60(g/mL)；选择上述提取工艺，以相同方法提取3批样品进行验证，测定从萱草花中提取出来的总黄酮提取量为14.87 mg/g。验证实验结果表明优选的提取工艺稳定可控。

3 讨 论

总黄酮类化合物极性较小，易溶于极性较小的有机溶剂，如甲醇、乙醇等，本实验先采用加热回流法对乙醇浓度、提取时间、物料比及提取次数进行单因素试验，如图1所示，随着乙醇浓度的持续增大，萱草花中提取的总黄酮的含量增多，当乙醇浓度为90%时，萱草花中总黄酮提取含量最高，所以90%乙醇浓度为最佳浓度。如图2所示，当提取时间为90 min时，总黄酮提取出的含量最高，故选定90 min为最佳提取时间；通过图3可以看出，物料比为1∶60(g/mL)时，总黄酮含量最高，因此1∶60(g/mL)为最佳物料比；由图4可知，提取2次的总黄酮含量最高，因此选择提取次数2次为最佳提取次数。

与其他分析方法相比，Box-Behnken 设计可以评价指标和因素间的非线性关系，操作方便，条件预测性好，对实验影响因素研究更全面，可靠性高。建立的模型能够很好地预测出萱草花总黄酮提取量，预测值与实际提取量差异较小，可以应用到其他药材总黄酮提取工艺中。本实验采用紫外-分光光度法建立了萱草花总黄酮的提取量测定方法，在单因素试验基础上，进行响应面法实验。表3结果显示，模型的拟合度值为0.000 6(P<0.01)，证明模型拟合度极显著，可以理想地拟合各因素对萱草花总黄酮提取量的影响结果，模型的失拟项为0.223 3(P>0.05)，代表失拟项不显著，说明此模型的实验误差相对较小。各因素影响强弱依次为：A>C>B。两两因素交互作用分析对其提取工艺进行了优化，如图5、6、7所示，随着溶剂浓度的持续增加，萱草花中总黄酮提取含量呈现先上升后下降的趋势，当乙醇浓度为90%，提取时间为90 min时，总黄酮被提取出的含量达到最大值。图5响应面的坡度趋势较陡，等高线为椭圆形，结果表明，乙醇浓度与提取时间有很强的交互作用，乙醇浓度曲线比提取时间曲线更陡，说明乙醇浓度对总黄酮提取量的影响大于提取时间(A>B)；图6等高线近似圆形，说明乙醇浓度与物料比交互作用较弱。图7响应面的坡度趋势较陡，等高线为椭圆形，结果表明，提取时间与物料配比的交互作用较强。因此从响应面的走势程度可以看出，乙醇浓度对提取的总黄酮含量的影响最显著，其次是物料比，最后是提取时间(A>C>B)，与方差分析结果一致。

图6 乙醇浓度与物料比对萱草花总黄酮提取含量的响应曲面及等高线图

图7 提取时间与物料比对萱草花总黄酮提取含量的响应曲面及等高线图

通过以上分析，认为实验方法可靠，最终总黄酮最优提取工艺条件为：乙醇浓度 90%、提取时间 90 min、物料比 1∶60 (g/mL)、提取2次，在此条件下，萱草花总黄酮提取量为14.87 mg/g，验证实验的结果与理论预测值相符良好。本研究确定了萱草花总黄酮的提取工艺，并为企业进一步有效开发萱草的提取利用、提高效率奠定了实验基础。