抑草圈种植下水稻和稗草根际土壤酶活性和微生物群落变化

马华燕, 王艳萍, 林舜贤, 何海斌, 李家玉

(福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002)

水稻(OryzasativeL.)作为世界上最主要的粮食作物之一，养活了世界约50%的人口，为人类提供了19%的膳食能量[1]，自20世纪70年代中期以来，除草剂应用的数量、种类逐年增加，然而长期过量使用除草剂会使杂草产生抗性和再生猖獗等问题，并且除草剂的残留关系着粮食的安全生产[2].稗草(EchinochloacrusgalliL.)是主要的稻田杂草之一，影响着水稻的生长发育和产量[3].化感水稻可通过根系释放、叶片淋溶、秸秆分解等方式向环境释放酚酸类、黄酮类、萜类等化感物质[4-7]，抑制田间杂草的生长发育，提高水稻产量[8-10].研究表明[11-13]，通过杂草胁迫和稗草种植液诱导有利于促进水稻分泌化感物质，从而提高水稻抑草潜力.在水培条件下[14]，稗草和水稻混种时与水稻酚类化合物合成相关的PAL、C4H、F5H、COMT基因上调表达，可提高水稻的化感抑草潜力.也有研究表明[15-17]，采用稻/稗共培抑草圈土培种植法能够模拟大田种植的水稻对稗草的化感抑制作用，已经成为研究水稻化感作用的重要种植模式.化感水稻的抑草模式主要是通过根系分泌化感物质，以土壤为媒介，传输到受体根际从而形成抑草圈，在此过程中，水稻和稗草土壤中的酶活性和微生物种群受到一定程度的干扰或促进，从而影响水稻的化感抑制作用[18].研究表明[19]，三叶期旱作水稻根际土壤的脲酶、多酚氧化酶活性与水稻化感潜力呈显著负相关，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性与水稻化感潜力呈显著正相关.化感水稻PI312777 根际土壤脲酶、蛋白酶和蔗糖酶活性高于非化感水稻Lemont，经过稗草种植液诱导后，化感水稻PI312777根际土壤的多酚氧化酶、蔗糖酶和磷酸单酯酶活性显著提高[12-13].从化感水稻PI312777水培液中分离出粘细菌属Myxococcussp.，外源添加酚酸类化感物质(对羟基苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸)，阿魏酸可以显著提高粘细菌的数量[20].化感水稻分泌的黄酮类物质5,7,4′-trihydroxy-3′,5′-dimethoxyflavone显著降低土壤中的真菌数量，而其在土壤中的降解产物苯甲酸物质提高水稻根际土壤中的细菌数量[21].旱直播模式下强弱化感水稻根际土壤中的微生物群落结构存在较大的多样性[22].以上研究结果均表明，植株根际土壤的酶活性和微生物群落与其化感作用的发挥显著相关，但同时监测化感作用的供体植株和受体植株根际土壤的酶活性和微生物变化还未见相关报道.本试验利用前期建立的稻/稗共培抑草圈土培种植法，探究化感作用供体(水稻)和化感作用受体(稗草)共培下水稻化感潜力与两者根际土壤酶活性和微生物变化之间的关系，为揭示水稻化感作用的微生态变化提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

供试品种为国际公认的强化感潜力水稻PI312777(PI，籼稻)和非化感水稻Lemont (LE，粳稻)[23]，采用自然条件下土壤种植.

试验于2021年6—9月在福建农林大学室外网室进行.取12 kg土壤于塑料盆中，加水并搅拌均匀，静置1 d.在每个盆的中心均匀播下5颗预萌发的2种水稻种子，每天补充水分以保持土壤湿润，并拔出试验过程中长出来的杂草.待水稻长到5叶期，距水稻12 cm处均匀播下5颗预萌发的稗草种子，以2种水稻和稗草共培种植为试验组，以单种稗草为对照组，每个处理设置3个重复.待稗草移栽2周后，收集稗草地上部并测定其株高、干鲜重，计算抑制率.

1.2 水稻和稗草根际土壤收集

参照抖落法分别收集水稻和稗草的根际土壤[24]，将每个处理的3个重复的水稻或稗草根际土壤收集后混匀，过1 mm筛，再重新三等分用于后续试验.2种水稻的根际土壤分别记为PI和LE，3种稗草的根际土壤分别记为CK-稗,PI-稗,LE-稗.

土壤酶活性参照李振高等[25]的方法测定.各酶检测方法简述如下：脲酶采用苯酚钠比色法，以24 h后1 g干土中氨基氮的含量表示酶活性；蔗糖酶采用硝基水杨酸比色法测定，以24 h后1 g干土中葡萄糖的含量表示酶活性；蛋白酶采用Folin-Ciocslteu比色法测定，以24 h后1 g干土中氨基氮的含量表示酶活性；过氧化物酶采用紫色没食子酸比色法测定，以2 h后1 g干土中紫色没食子素的含量表示酶活性.各酶活性测定3个重复.

1.3 水稻和稗草根际土壤微生物多样性测定

根际土壤微生物功能多样性采用 BIOLOG ECO微平板法测定[26]：取5g新鲜土壤置于100 mL灭菌组培瓶中，加入45 mL 0.85%的NaCl灭菌溶液，封口，120 r·min-1振荡10 min，冰浴静置2 min，取上清液5 mL，置于装有45 mL灭菌超纯水的100 mL灭菌组培瓶中混匀，重复1次，制得1∶1 000的土壤提取液，用于 ELSIA反应.试验前将 BIOLOG ECO平板置于25 ℃预热，使用移液枪吸取150 μL提取液于各孔中，置于28 ℃恒温培养箱进行培养，每24 h采用酶标仪(INFINITE 200 PRO, Tecan, Austria)读取各反应孔在590 nm处的吸光值，连续读取168 h，试验设置3次重复.以BIOLOG ECO平板中每孔颜色平均变化率(average well color development, AWCD)表示土壤微生物群落ELISA反应的结果.AWCD=[∑(C-R)]/31，其中C是所测定的31个碳源孔的吸光值，R为对照孔的吸光值.根据 BIOLOG微生态板中的31种单一碳源分类，将碳源分为糖类、氨基酸类、羧酸类、胺类、多聚物类和酚酸类[11].

1.4 数据分析

水稻对稗草生长的抑制率计算公式：抑制率/%=[(单种组生长指标-共培组生长指标)/单种组生长指标]×100.数据分析过程中的方差分析、显著性分析使用DPS 软件进行，相关性分析采用IBM SPSS Statistics 19进行，主成分分析采用Origin 2021软件进行.

2 结果与分析

2.1 水稻抑草效应

试验结果表明(表1)：稗草的株高、地上部鲜重和地上部干重均表现为CK-稗>LE-稗>PI-稗草，且存在显著差异.从抑制率上看，化感水稻PI312777对稗草的株高、鲜重及干重的抑制率均显著高于非化感水稻Lemont(P<0.05).此结果与前期抑草圈种植试验的结果一致，表明12 cm为合适的水稻对稗草化感抑草圈的距离，此时水稻和稗草根际的土壤能够代表化感作用的供体和受体供下一步研究.

表1 不同化感潜力水稻对稗草的抑制率1)Table 1 Inhibition rate of barnyard grass by rice with different allelopathic potential

2.2 根际土壤酶活性分析

水稻根际土壤酶活性测定结果表明(表2)，当在12 cm距离处种植稗草后，不同化感潜力水稻根际土壤的过氧化物酶、蛋白酶、蔗糖酶和脲酶活性存在差异.化感水稻PI312777根际土壤的过氧化物酶、蔗糖酶、脲酶活性均高于非化感水稻Lemont根际，其中过氧化物酶和蔗糖酶达到了显著水平(P<0.05)，两种酶活性分别升高了1.05、1.63倍.

表2 不同化感潜力水稻的根际土壤酶活性1)Table 2 Enzyme activity in rhizosphere soil of rice with different allelopathic potential

稗草根际土壤酶活性测定结果表明(图1)：与单种稗草相比，与化感水稻PI312777共培的稗草根际土壤的过氧化物酶、蛋白酶活性呈下降趋势，其中蛋白酶活性下降达到了显著水平(P<0.05)，降低了14.76%；而蔗糖酶、脲酶活性均显著增加(P<0.05)，分别增加了1.35、1.66倍.与单种稗草相比，与非化感水稻Lemont共培的稗草根际土壤的过氧化物酶、蛋白酶、脲酶活性均呈上升趋势，其中蛋白酶、脲酶活性升高达到了显著水平(P<0.05)，分别增加了1.10、1.38倍，而蔗糖酶活性显著降低(P<0.05)，降低了53.55%.

CK-稗：单种稗草；LE-稗：稗草与Lemont共培；PI-稗：稗草与PI312777共培. 小写字母表示在P<0.05水平的显著性差异.图1 与水稻共培后稗草根际土壤的酶活性Fig.1 Effect of co-culture with rice on soil enzyme activities in barnyard grass rhizosphere

2.3 根际土壤微生物碳源代谢特征(BIOLOG)分析

水稻和稗草的根际土壤微生物碳源代谢特征分析结果表明(图2)，土壤中的微生物对碳源的利用率随着培养时间的增加逐渐升高.从48 h开始，与稗草共培时，非化感水稻Lemont根际土壤微生物对碳源的利用程度显著高于化感水稻PI312777根际；而在稗草根际，与Lemont共培的稗草根际土壤微生物的碳源利用程度显著高于单种稗草，同时也显著高于与PI312777共培的稗草根际(P<0.05)，总体上，水稻根际土壤的AWCD高于稗草根际.

PI-稗：与PI312777共培的稗草；LE-稗：与Lemont共培的稗草；PI：与稗草共培的PI312777；LE：与稗草共培的Lemont；CK-稗：单种稗草.图2 根际土壤碳源平均颜色变化率(AWCD)变化Fig.2 Variation on average color change rate of carbon sources in rhizosphere soil co-cultured by rice and barnyard grass

比较水稻和稗草根际土壤微生物对6大类碳源利用程度，结果表明(表3)，与稗草共培后，化感水稻PI312777根际土壤微生物对氨基酸类、糖类和酚酸类的利用程度显著高于非化感水稻Lemont，分别高了1.53、2.46、1.75倍(P<0.05)，而多聚物类、羧酸类的利用程度显著低于非化感水稻Lemont，分别低了41.48%、80.60%，对胺类的利用程度无显著差异.

表3 水稻根际土壤微生物对六大碳源的利用水平1)Table 3 Utilization of 6 carbon sources by microorganism in rice rhizosphere soil

结果表明(图3)，与单种稗草相比，化感水稻PI312777共培的稗草根际土壤微生物对氨基酸类、多聚物类、酚酸类、羧酸类的利用程度呈下降趋势，且达到了显著水平，分别降低了48.34%、40.49%、50.80%、47.80%，对糖类的利用率显著升高，升高了2.08倍(P<0.05)；而与非化感水稻Lemont共培的稗草根际土壤微生物对碳源的利用率均呈上升趋势，其中羧酸类、糖类的利用率达到了显著水平，分别升高了1.50和3.14倍(P<0.05).两种水稻抑草圈距离处的稗草根际土壤中的微生物对胺类碳源的利用率无显著性差异.

CK-稗：单种稗草，LE-稗：稗草与Lemont共培；PI-稗：稗草与PI312777共培.小写字母表示在P<0.05水平的显著性差异.图3 稗草根际土壤微生物对碳源的利用率Fig.3 Utilization of carbon sources by microorganisms in barnyard grass rhizosphere soil

稗草根际土壤微生物对31种碳源利用率划分为2大成分(图4)，主成分1(PC1)的贡献率为59.7%，主成分2(PC2)的贡献率为40.3%；与非化感水稻Lemont共培的稗草根际土壤微生物对碳源的利用率在PC1正端，与化感水稻PI312777共培的稗草根际土壤微生物对碳源的利用率在PC1的负端，且大多数碳源的相关系数都指向PC1正端方向.其中与PC1正相关系数最高的单一碳源为α-环式糊精、苯乙胺，而与PC1负相关系数最高的单一碳源为L-天门冬酰胺、肝糖；与PC2正相关系数最高的单一碳源为i-赤藓糖醇、D-甘露醇，与PC2正相关系数最高的单一碳源为L-苏氨酸和α-丁酮酸.

CK-稗：单种稗草，LE-稗：稗草与Lemont共培；PI-稗：稗草与PI312777共培.图4 根际土壤微生物BIOLOG数据主成分分析Fig.4 Principal component analysis of rhizosphere soil microorganisms via BIOLOG

2.4 相关性分析

稗草生长指标与稗草根际土壤微生物碳源利用的相关性分析表明(表4)，两种水稻对12cm抑草圈处稗草的株高、鲜重、干重抑制率与多聚物类、羧酸类碳源利用率呈显著负相关(P<0.05)，而这些抑制率又与酚酸类碳源利用率呈显著正相关，鲜重抑制率与氨基酸类碳源利用率呈显著正相关，干重抑制率与糖类利用率呈显著正相关(P<0.05)，同时水稻对稗草的抑制率与水稻根际土壤的过氧化物酶和蔗糖酶活性呈显著负相关，与蛋白酶活性呈显著正相关(P<0.05).稗草株高与根际土壤微生物对氨基酸类碳源的利用呈显著正相关(P<0.05)，与酚酸类碳源利用率呈极显著负相关(P<0.01).同时，由于不同化感潜力水稻的抑制作用，稗草的生长(株高、地上部鲜重和地上部干重)与脲酶活性呈极显著负相关系(P<0.01).

表4 水稻化感潜力及稗草生长量与水稻根际土壤酶活和微生物碳源利用的相关性1)Table 4 Correlation between rice allelopathic potential, barnyard grass growth, enzyme activity and microbial utilization of carbon source in rice rhizosphere soil

3 讨论

研究表明[27]，强化感水稻PI312777对稗草的抑制效果显著高于非化感水稻Lemon，本试验结果也表明，化感水稻PI312777对稗草株高、鲜重、干重的抑制率显著高于非化感水稻Lemont(表1).土壤酶参与土壤中的各类生物化学反应[28]，田间杂草的存在和稗草种植液诱导对土壤酶活性和土壤微生物的影响显著[12]，本试验中与不同化感潜力水稻共培的稗草根际土壤酶活性存在显著区别.水稻化感作用潜力的变化与土壤微生物的活动关系密切，化感物质可影响微生物的生长发育，如提供营养物质从而促进微生物繁殖和聚集[29-30]，同时微生物也能反作用于植物，影响化感物质的分泌和消耗，甚至能影响化感物质在土壤中的迁移分布[31].不同化感潜力的水稻对土壤微生物对于碳源的利用率存在显著区别，证明不同化感潜力水稻和稗草共培可影响土壤微生物的活动.

蔗糖酶能促进土壤中的营养物质，与土壤有机质含量、微生物数量相关，脲酶活性与土壤氮素循环相关[28]，化感水稻PI312777比非化感水稻Lemont能分泌更多酚酸类、黄酮类化合物[31]，土壤中酚酸含量过高会抑制土壤脲酶、蔗糖酶、蛋白酶活性[32].在本试验中，与稗草共培的化感水稻PI312777根际土壤中的过氧化物酶、蔗糖酶、脲酶活性高于非化感水稻Lemont根际，与林瑞余等[19]关于化感水稻抑制根际土壤的过氧化物酶和脲酶活性的研究结果存在一定差异，主要因为在稗草共培条件下，化感水稻根际土壤酶的活性也会提升，与张奇等[13]稗草种植液诱导可提高过氧化物酶、蔗糖酶活性，降低蛋白酶活性的结论相一致.王礼科等[33]研究表明，半夏连作随着种植年限的增加，逐渐积累2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)而导致脲酶活性升高，在本试验中，化感水稻根际土壤中的脲酶活性也高于非化感水稻，与其结论一致.与化感水稻PI312777共培的稗草根际土壤中蔗糖酶和脲酶活性比单种稗草显著提高，而与非化感水稻Lemont共培的稗草根际土壤的蔗糖酶活性显著降低，脲酶活性提高(图1)，这可能是因为化感水稻根系分泌的化感物质传输到12cm处稗草根际土壤，稗草通过提高根际土壤中的营养物质的吸收来部分削弱水稻的化感抑制作用，此结论还需进一步证实.相关性分析表明，在抑草圈种植模式下，水稻对稗草的抑制率与水稻根际土壤的过氧化物酶和蔗糖酶活性呈显著负相关，与蛋白酶活性呈显著正相关，稗草的生长与稗草根际土壤的脲酶活性呈极显著负相关，这些结果表明，化感水稻根系分泌的化感物质会同时影响化感作用供体和受体植株根际土壤的酶活，这些酶活性也会影响供体对受体的化感潜力.

一些植物释放的化学物质能够抑制土壤微生物[34]，本试验通过BIOLOG微平板分析表明，受到12cm抑草圈距离生长的稗草影响，化感水稻PI312777根际土壤碳源AWCD低于非化感水稻Lemont根际土壤(图2)，表明化感水稻在土壤中分泌的一些化感物质抑制了土壤微生物的生长和聚集，这与张奇等[11]的研究结果存在差异，可能是由于土壤环境较复杂，稗草在土壤中生长胁迫与直接添加稗草根系分泌物存在差异所导致.也有研究表明[35]，通过BIOLOG分析外源添加一定量的百合自毒物质邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和2,4-二叔丁基苯酚(2,4-DTBP)，土壤碳源AWCD显著下降，此结果与本试验结果一致.化感水稻根系分泌的化感物质会在土壤中积累，并与土壤中的微生物产生非常复杂的作用[36]，稗草根际对非糖类碳源的利用率均表现出与非化感水稻Lemont共培的高于单种稗草，也高于强化感水稻PI312777共培组(图3)，这也意味着水稻分泌的化感物质可能抑制了水稻和稗草根际土壤微生物的繁殖和活动.相关性分析表明，水稻对于稗草的抑制率与多聚物、羧酸类碳源的利用率呈显著的负相关(表4)，这与张奇等[11]的研究存在一定差异，可能是水稻在抑制稗草生长时消耗了多聚物和羧酸类物质，但稗草抑制率与酚酸类碳源利用率呈显著正相关(表4)的结果是一致的，同时稗草的生长与其根际土壤中微生物对酚酸类碳源利用呈负相关，这些结果暗示水稻根系分泌的酚酸类化感物质会同时影响供体和受体植株根系土壤中微生物种群的多样性，进而影响受体植株的生长.在后续研究中，可以对此类利用酚酸类碳源的微生物进行筛选和确定，通过增加微生物活动提高水稻的抑草潜力.

水稻和稗草共培影响化感作用供体和受体植株根际的土壤酶活性和土壤微生物种群，在水稻周围生长的稗草影响水稻根际的土壤酶活性与土壤微生物，同时水稻分泌化感物质抑制稗草的生长，也影响着稗草根际土壤的酶活性和微生物群落，这为通过影响土壤微生物群落和酶活性，改变土壤微生态环境，进而控制农田杂草，减少化学除草剂的使用提供了一定的参考意义.但稗草根际与水稻根际土壤中化感物质与微生物的互作机制较为复杂，目前研究报道，黄酮类、酚酸类物质能有效影响土壤细菌和真菌的聚集，但是具体还有哪类化感物质起作用，影响哪类土壤微生物群落改变还有待于进一步研究.