ARN患者房水VZV DNA和IgG抗体检测在抗病毒疗效 评估中的价值

李 程， 周 旻， 雷博雅， 常 青， 曹文俊， 王朱健

（1. 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院检验科，上海 200031；2. 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科，上海 200031）

急性视网膜坏死（acute retinal necrosis，ARN）是一种严重的急性致盲性眼病，主要病因是疱疹病毒感染，包括水痘带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）、单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）1型和2型、人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV），以VZV最为常见。ARN病情发展迅速，预后较差，及时诊断、治疗对预后至关重要。临床上主要根据临床表现评估患者病情和抗病毒治疗效果。患者临床表现不典型，或出现晶状体、玻璃体浑浊进而会影响眼底观察，干扰诊断。目前，ARN的治疗剂量、时间和治疗方式尚无统一标准，需要客观、有效的指标来评估ARN的治疗效果。2015年，日本眼科协会把眼内液病毒核酸和抗体检测纳入ARN的诊断标准[1]，为ARN的诊断提供了新的依据。本研究拟通过动态监测接受抗病毒治疗的ARN患者房水中VZV DNA载量和IgG抗体的水平，探讨其在疗效评估中的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年12月—2019年12月复旦大学附属眼耳鼻喉科医院确诊为ARN的患者11例，其中男7例、女4例，年龄38～73岁，诊断标准参照美国葡萄膜炎协会相关标准[2]。所有患者均为单眼发病，确诊前均未接受抗病毒治疗，排除免疫缺陷疾病。ARN患者确诊后均接受8周的强化抗病毒治疗，包括玻璃体腔注射、静脉注射和口服抗病毒药物。本研究经复旦大学附属眼耳鼻喉科医院医学伦理委员会批准，所有患者自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 ARN患者在眼内注射药物之前行前房穿刺术，取患病眼房水100 μL。随后在治疗第4天、1周、2周、3周、4周和8周分别采集房水100 μL，-80 ℃冻存。对房水样本先采用多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）进行病毒定性检测，检测的病毒包括HSV-1、HSV-2、VZV、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）。VZV DNA阳性患者再采用实时荧光定量PCR检测病毒载量。

1.2.2 VZV DNA定量检测 将VZV DNA标准品进行10 倍系列梯度稀释，作为模板，采用ABI7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）进行实时荧光定量PCR，VZV DNA检测试剂盒购自武汉百泰基因工程有限公司。严格按试剂和仪器说明书操作，VZV DNA检出限为1×103拷 贝/mL。

1.2.3 VZV IgG抗体检测 将冻存的房水样本取出，平衡至室温，采用酶联免疫吸附试验检测VZV IgG抗体，试剂盒购自德国VirionSerion公司，检测仪器为Sunrise酶标仪（瑞士TECAN公司）。严格按仪器和试剂盒说明书进行操作。以房水S/CO值高于阴性对照的x +2s为阳性。

1.3 统计学方法

采用MedCalc 15.8软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以x ±s表示，多组间比较采用ANOVA检验。呈非正态分布的计量资料以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Friedman非参数检验。采用Spearman秩相关分析评估病毒载量对数值与其他指标之间的相关性。回归模型决定系数用r2值表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARN患者VZV DNA载量的变化

11例ARN患者治疗前房水VZV DNA载量为（6.97±0.57）lg（拷贝/mL），病毒载量范围为5.94～7.83 lg（拷贝/mL）。随着抗病毒治疗时间的延长，患者房水VZV DNA载量整体呈下降趋势（P＜0.000 1），治疗第4天病毒载量即显著下降（P=0.003）；第3、4周降幅变缓， 2个时间点之间VZV DNA载量差异无统计学意义（P=0.208）。见表1、图1。

2.2 ARN患者VZV IgG抗体水平的变化

11例ARN患者治疗前房水VZV IgG抗体水平（S/CO值）为4.84±1.72，范围为1.83～6.92，与治疗前VZV DNA载量呈正相关（r=0.45，P＜0.05）。接受抗病毒治疗后，ARN患者房水VZV IgG抗体水平呈下降趋势（P=0.001）。治疗8周时房水VZV IgG抗体水平显著低于治疗前（P＜0.05），但仍呈阳性，S/CO值范围为0.40～6.28。见表2。

表1 抗病毒治疗前后各时间点房水VZV DNA水平的变化

图1 11例ARN患者房水VZV DNA载量的动态变化

表2 ARN患者抗病毒治疗前后各时间点房水VZV IgG抗体水平（S/CO值）的变化

2.3 ARN患者VZV DNA载量和IgG抗体变化动力学分析

VZV DNA载量变化呈双相指数下降，第一相（VZV DNA载量变化＜0.5个对数值）持续时间为4～17 d，平均为（10.1±3.8）d。第一相持续时间与治疗前VZV DNA载量无相关性（r=0.09，P＞0.05）。对第二相进行动力学分析，结果显示，有7例拟合度较高（r2＞0.8），VZV DNA载量随时间呈对数模型衰减，平均斜率为-0.106±0.038（95%CI为-0.173～ -0.059），斜率与治疗前VZV DNA载量无相关性（r=0.22，P＞0.05）。患者VZV DNA载量降低50%的时间为（3.2±1.1）d（95%CI为1.7～ 5.1 d）。治疗8周后，11例ARN患者中，有10例（90.91%）房水VZV DNA低于检测下限。房水VZV IgG抗体水平在治疗1、2、3、4周无明显变化；治疗8周后，11例ARN患者VZV IgG抗体仍均呈阳性。见图1、图2。

图2 11例ARN患者房水VZV IgG抗体水平动态变化

3 讨论

已有研究证实，通过检测眼内液病毒核酸和抗体来诊断ARN具有重要的临床应用价值[3-4]， 但尚缺乏对眼内液病毒核酸和抗体在抗病毒治疗中的动态监测及疗效评估的研究。为此，本研究通过对接受抗病毒治疗的ARN患者房水VZV DNA载量及IgG抗体水平进行动态监测，分析VZV对抗病毒治疗的动态反应，同时评估疗效。

目前，临床一般采用全身静脉注射抗病毒药物联合玻璃体腔注射更昔洛韦的方法来治疗ARN，疗效良好[5]。本研究结果显示，ARN患者接受抗病毒治疗1周左右房水VZV DNA载量即大幅下降，治疗8周时，有10例患者VZV DNA载量低于检测下限，且视网膜坏死灶均消退，证实8周强化疗法可有效降低ARN患者眼中的VZV载量。有研究结果显示，实时荧光定量PCR可有效检测ARN患者VZV活跃性，并监测抗病毒治疗的效果[6-7]。在ARN的治疗过程中，玻璃体腔注射前，为降低眼内压，一般会通过前房穿刺术抽取房水，抽取出来的房水可进行实时荧光定量PCR检测，不会对患者造成额外损伤，临床上具有可操作性。本研究结果显示，ARN患者接受抗病毒治疗后，VZV DNA载量变化呈双相指数[8]下降，这一现象在接受抗病毒治疗的乙型肝炎患者中也有呈现[9]。本研究ARN患者第一相的持续时间为（10.1±3.8）d，明显短于BERNHEIM等[8]报道的27.8 d和HAFIDI等[10]报道的15.5 d，原因可能与治疗方案和病毒对药物的敏感性有关；ARN患者VZV DNA载量下降50%的时间为（3.2±1.1）d，与BERNHEIM等[8]报道的（3.0±0.7）d和HAFIDI等[10]报道的4.2 d无明显差异。本研究中，有1例患者在治疗第4周时出现VZV DNA载量的反弹，治疗第8周时，仍能检出VZV DNA，临床检查发现其视网膜坏死灶未完全消退，提示VZV DNA载量检测结果与患者临床表现相符。

VZV感染后，机体可在眼内产生局部免疫，产生以IgG为主的特异性抗病毒抗体。有研究结果显示，眼内HSV、VZV感染后1周即可产生特异性IgG抗体；感染3个月时，房水仍有较高的抗体阳性率[11]。本研究结果显示，11例ARN患者初次就诊时即可检测到VZV IgG抗体，S/CO值范围为1.83～6.92，与VZV DNA载量呈正相关（r=0.45，P＜0.05）。抗体滴度的高低由病毒和宿主两方面决定，病毒毒株的不同、病毒感染量的差异、宿主免疫力的差异、就诊时感染阶段的不同，均会导致患者的抗体产生情况出现差异。本研究结果显示，11名ARN患者接受抗病毒治疗后8周，VZV IgG抗体水平显著下降，但滞后于VZV DNA载量的变化，当VZV DNA载量低于检测下限时，VZV IgG抗体仍为阳性，S/CO值范围为0.40～6.28。由于目前尚无关于抗病毒治疗后房水VZV IgG抗体半衰期的研究，因此抗体的持续阳性是否对患眼有持续性的保护作用，防止ARN复发，还有待进一步研究。

本研究尚有一定的局限性：为不增加患者负担，获得最大临床获益率，本研究纳入的多数ARN患者因炎症导致临床无法准确评估疾病阶段；缺乏包括视网膜坏死灶面积等影像学检查结果，因此未能完成病毒拷贝数与影像学指标的动态相关性分析。后续将收集更多病例，完善相关检查，以全面评估VZV DNA载量和VZV IgG抗体检测的临床价值。

综上所述，采用实时荧光定量PCR检测VZV DNA载量可用于监测ARN病情的进展，亦可反映病毒对药物的反应，有利于及时发现病毒耐药，优化治疗方案，对ARN治疗具有重要的指导价值。