大豆鼓粒期叶片荧光参数与叶绿素含量的关系

李方舟 张海生 杨婷婷 王 军 古晓红

(山西农业大学农学院，山西 太原 030031)

大豆在人类和动物脂肪酸及蛋白质摄取来源中占有重要地位。大豆不仅是人类第二大食用油来源，同时也是最大的饲料蛋白来源[1]，保证大豆安全生产具有重要意义。据最新统计，2021—2022年度我国大豆新增供给量为11 240万吨，而国产大豆产量仅为 1 640 万吨[2]，远远不能满足国民需求，我国需求的大豆主要依赖于进口，对我国大豆产业造成了巨大影响，因此提高我国大豆产量迫在眉睫[2]。光合作用对大豆产量具有重要影响，而叶绿素是光合作用必不可少的物质[3]，同时也是光合能力、营养胁迫和衰老进程各阶段的良好指示剂[4]，可见测定叶绿素含量对大豆产量及健康状况监测具有重要意义[5]。

常见的叶绿素含量测定方法有三种：第一种为比色法[6-7]，主要是将叶片粉碎后用乙醇或丙酮提取叶绿素，然后用分光光度计进行比色测定，该方法能够准确测定叶绿素a/b和类胡萝卜素含量，但测定时间长且测定过程繁琐；第二种是用叶绿素计测定叶绿素的相对含量[8-9]，该方法操作简单，时效性强，不需要破坏植株，应用较为广泛；第三种是通过建立光谱模型来估算叶绿素含量[10-12]，该方法常用于遥感监测领域，具有无损、及时、大面积监测等优点。前人已就上述方法做了大量研究，但通过叶绿素荧光参数来估算叶绿素含量鲜有报道，该方法可实现叶绿素含量和叶片光合性能同步研究。如杨程等[13]建立了小麦叶绿素含量的估算方法，指出可以利用t=tFm时，单位叶截面的反应中心(reaction center of unit cross section,RC/CSM)，通过线性模型估算冬小麦叶片土壤与作物分析开发(soil and plant analyzer development, SPAD)值；杨艳阳等[14]研究发现茶鲜叶的叶绿素含量与685 nm处的荧光强度显著相关；王艺斐等[15]指出随着银杏叶片叶绿素含量的降低，PSⅡ最大光化学效率(maximal photochemical efficiency of PSⅡ,Fv/Fm)会显著下降，其他荧光参数也发生明显变化。在荧光参数方面，学者们主要研究逆境胁迫对植株荧光参数的影响，如原向阳等[16]研究指出缺磷胁迫下4.98 mL·L-1草甘膦处理的大豆叶片最大荧光(maximal fluorescence,Fm)、Fv/Fm呈下降趋势。王征宏等[17]指出，NaCl胁迫下大豆叶片可变荧光与初始荧光比(ratio of rate constants for photochemical reaction and nonphotochemical deactivation of PSII excitations,Fv/Fo)、Fv/Fm均显著降低。通过荧光参数估算大豆叶绿素含量还鲜见报道，因此本研究在大豆鼓粒期对叶片叶绿素含量与荧光参数进行相关分析，筛选出相关性极显著的荧光参数，建立并验证叶绿素含量监测模型，并通过通径分析对荧光参数排序，以期为大豆叶片叶绿素含量监测提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

本研究在山西农业大学东阳试验基地进行。该地区平均海拔800 m，气候类型为暖温带半湿润大陆性季风气候，无霜期158 d，年平均气温9.8℃，夏季炎热多雨，年平均降水量415～483 mm，年日照时数2 662 h[18]。

1.2 试验设计

本研究于2020—2021年开展试验。2020年设置50个小区，2021年设置55个小区，分别种植黄淮海不同大豆品种(表1)，小区行长6 m，宽3 m，大豆行距50 cm，株距20 cm。根据当地气候及大豆长势，进行间苗、中耕、灌溉、施肥。在大豆鼓粒期分别测量叶片叶绿素含量和荧光参数，获得105个样本数据，按照叶绿素含量从小到大顺序依次进行样本排列，从第3个样本起每隔2个样本选取一个作为验证集，最后选取结果为70个样本作为建模集，35个样本作为验证集。建模集中剔除7个异常样本，剩余63个样本；验证集中剔除7个异常样本，剩余28个样本。

表1 本研究选用大豆品种Table 1 Soybean varieties selected in this study

1.3 大豆叶绿素和荧光参数的测定

每小区选取生长一致的5株大豆植株，取其上部1完全展开叶片，进行暗处理30 min，用Handy PEA植物效率分析仪(英国Hansatech公司)测定其叶绿素荧光诱导动力学曲线，每片叶片重复测定3次，计算荧光参数(表2)，取其5片叶片平均值作为该小区的叶绿素荧光参数。

表2 荧光参数及表征意义Table 2 Fluorescence parameters and characterization significance

表1(续)

将采集的叶片放入密封袋低温保存，带回实验室，用UV-1800型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)测量叶片在665、649、470 nm处的吸光度，利用以下公式计算叶绿素含量[19]。

LCT=LCa+LCb

式中，LCa(leaf chlorophyll a content)为叶片叶绿素a的含量；LCb(leaf chlorophyll b content)为叶片叶绿素b的含量；LCT(leaf total chlorophyll content)为叶片总叶绿素的含量；A665和A649分别为光合色素溶液在665和649 nm处的吸光度；V为提取液的体积；FW(fresh weight)为叶片鲜重。取小区5片叶的叶绿素含量平均值作为该小区的叶绿素含量。

1.4 模型的构建与检验

利用Origin 2021软件对叶绿素含量与荧光参数进行相关性分析，用Excel 2010建立叶绿素监测模型，用SPSS 19软件构建多元逐步回归模型并进行通径分析，通过验证集对模型进行验证，依据决定系数(coefficient of determination,R2)、均方根误差(root mean squared error, RMSE)、预测残差(residual prediction difference, RPD)对模型进行评价。其中R2越接近1，RMSE越小，表明模型预测精度越高；当RPD>1.4时，具有较好的预测能力，当RPD<1.4时，预测能力较差[20]。

式中，n为样本总数；p为模型的变量个数；Yi为实测值；Yi′为预测值。

2 结果与分析

2.1 叶绿素描述性统计分析

由表3可知，建模集63个样本中叶绿素含量最大值为3.14，最小值为1.04，均值为2.07，标准差为0.51，变异系数为0.25；验证集28个样本中叶绿素含量最大值为3.08，最小值为1.05，均值为1.90，标准差为0.53，变异系数为0.28。建模集叶绿素含量的范围较验证集大，而均值和标准差相差不大，为模型的建立和验证提供了理论基础。全部集的统计描述均与建模集、验证集相差较小，且变异系数均较小，表明模型具有可行性。

表3 大豆叶片叶绿素含量描述性统计分析Table 3 Descriptive statistical analysis for chlorophyll content of soybean leaves

2.2 相关性分析

对所选的29个荧光参数与叶绿素含量进行相关分析，绘制相关系数图，如图1所示。16个荧光参数与叶绿素含量呈正相关关系，除VI、Sm与叶绿素含量不显著相关外，其他14个荧光参数均与叶绿素含量达到极显著正相关，其中Fv/Fo、φPO、ψEO、φEO、ETO/CSM和PIABS的相关系数较大，分别为0.78、0.76、0.75、0.80、0.82和0.77。13个荧光参数与叶绿素含量呈负相关关系，除tFM、N与叶绿素含量不显著相关外，其他11个荧光参数均与叶绿素含量达到极显著负相关，其中VJ的相关系数较大，为-0.75。

注：*和**分别表示相关性在0.05和0.01水平达到显著和极显著。Note：* and ** indicate the correlation was significant and extremely significant at 0.05 and 0.01 level, respectively.图1 荧光参数与叶绿素含量相关矩阵图Fig.1 Correlation matrix between fluorescence parameters and chlorophyll content

2.3 基于荧光参数的叶绿素含量模型构建

通过相关性分析，筛选出7个与叶绿素相关关系较大的荧光参数作为自变量，叶绿素含量作为因变量，通过建立指数方程、线性方程、对数方程、多项式方程和幂函数方程，筛选出各荧光参数决定系数最大的回归方程，结果如表4所示。建立的所有回归方程R2在0.562 5～0.713 9之间，其中以VJ和ψEO为自变量建立的模型R2最小，R2均为0.562 5，且回归模型均为多项式回归；以ETo/CSM为自变量建立的幂函数模型R2最大，为0.713 9，表明该模型具有较好的预测效果。

表4 不同荧光参数的叶绿素含量监测模型Table 4 Chlorophyll content monitoring models with different fluorescence parameters

2.4 基于荧光参数的叶绿素含量多元回归模型构建

由于叶绿素受多种基因控制，其含量可能受多种荧光影响，因此，建立叶绿素含量多元回归模型具有重要意义。以筛选出的7个与叶绿素相关关系较大的荧光参数与叶绿素含量建立多元逐步回归模型如下：

y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+

0.077x4+0.076(R2=0.694)

式中，x1为Fv/Fo；x2为φPO；x3为ETO/CSM；x4为PIABS。回归方程决定系数R2为0.694，具有较好的预测性。

2.5 模型的检验

为了验证模型的精确性和准确性，利用验证集的荧光参数分别代入各模型，计算叶绿素含量预测值，然后利用预测值与实测值建立1∶1图(图2)，根据R2、RMSE、RPD对模型进行综合评价。

由图2可知，多元逐步回归模型预测值和实测值离 1∶1 线较近，该模型的决定系数R2为 0.805 8， 预测残差RPD最大，为1.773 8，均方根误差RMSE最小，为0.293 4，表明多元回归模型预测效果最佳。

图2 叶绿素含量预测值与实测值1∶1线性图Fig.2 1∶1 linear diagram of predicted and measured chlorophyll content

2.6 荧光参数的通径分析

通过叶绿素含量多元逐步回归模型，获得通径系数(表5)。结果表明，4个自变量对叶绿素含量的直接作用中，ETO/CSM对叶绿素含量直接作用最大，φPO次之，Fv/Fo对叶绿素含量起直接负作用，PIABS直接作用最小。通过分析间接通径系数可知，ETO/CSM通过φPO对叶绿素含量的间接作用较大，二者的间接通径系数为0.325；φPO与ETO/CSM间接通径系数最大，为0.601，表明φPO通过ETO/CSM对叶绿素含量具有较大的作用；ETO/CSM、φPO、PIABS三个荧光参数通过Fv/Fo均对叶绿素含量起负作用。

表5 荧光参数与叶绿素含量的通径分析Table 5 Path analysis of fluorescence parameters and chlorophyll content

3 讨论

本试验将黄淮海不同大豆品种作为研究对象在2020-2021年分两年进行研究。因品种间地理跨度大，遗传基础不同，导致品种间生长发育的进程不同，机体内叶绿素含量等生理指标差异明显；同时用两年数据统计分析，表明两年数据时间上也有差异性。鼓粒期是大豆产量和品质形成的重要生育时期[21]，大豆在鼓粒期进行蛋白质和脂肪的贮藏。胡铁欢等[22]研究指出大豆在鼓粒期受干旱胁迫后，百粒重降低20%，产量平均下降4%，脂肪含量增长1%，蛋白质含量显著降低。本研究选用鼓粒期的大豆叶绿素进行研究具有可行性。

光合作用是作物产量和品质形成的基础，作物中有机物的95%来源于光合作用[23]。叶绿素荧光参数和光合作用中各种反应过程密切相关[24]。光合作用的能量变化可以通过叶绿素荧光诱导动力学曲线来反映。叶绿素荧光动力曲线获取及导出的荧光参数可以表征叶绿素含量的变化。叶绿素荧光能够灵敏地反映叶片光合作用的变化，是研究光合作用的探针[25-27]。本研究发现，对叶绿素含量影响最大的荧光参数为ETO/CSM，φPO(Fv/Fm)次之，Fv/Fo对叶绿素含量起直接负作用，PIABS直接作用最小。前人对冬小麦荧光参数与叶绿素含量做了相关的研究，如杨程等[13]研究发现冬小麦SPAD值与RC/CSM、ETO/CSM和φPO呈极显著正相关，所筛选的荧光参数与本试验筛选的荧光参数都包括ETO/CSM和φPO，这主要是由于ETO/CSM表征tFM单位叶截面电子传递的能量通量；φPO反映了光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ, PSⅡ)反应中心吸收光子后捕获能量的能力，所以ETO/CSM、φPO都与植物的光合效率有关，而叶绿素含量的高低反映了植物光合效率的强弱，光合效率的变化会影响光能的吸收、传递和转化，最主要表现是引起荧光参数的变化[28]，因此，ETO/CSM和φPO为本研究筛选的荧光参数。不同的是，杨程等[13]研究表明以RC/CSM为自变量建立的SPAD模型效果最佳，而本研究则是以ETO/CSM、φPO、Fv/Fo和PIABS建立的多元回归模型效果最佳，原因可能是本研究与其研究作物及叶绿素测定方法不同，加之大豆叶绿素受多基因控制，并受多种荧光参数共同影响。另外，王正航等[29]研究发现小麦开花期的叶绿素含量与荧光参数Fo、Fm、Fv、Fv/Fo、φPO呈极显著相关，本研究通过通径分析同样发现Fv/Fo对叶绿素含量起直接负作用，φPO对叶绿素含量起较大的直接作用，可见这两个荧光参数能够反映一定的光合能力。杨峰等[30]在根腐病胁迫下，研究了大豆叶片荧光参数与叶绿素含量的关系，结果表明φPO与叶绿素含量的相关系数达到了0.952，而本研究中φPO与叶绿素含量直接通径系数为0.382，排第二，差异可能是由本研究所用大豆未受根腐病胁迫所致。

通过对比8个模型的R2及验证模型的R2、RMSE、RPD，表明多元逐步回归模型y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+0.077x4+0.076(R2=0.694)(x1为Fv/Fo；x2为φPO；x3为ETO/CSM；x4为PIABS；y为叶绿素含量)的预测效果最佳。但植物在受到逆境胁迫，如干旱胁迫[31]、盐胁迫[32-34]、冷冻胁迫[35]时，其荧光参数和叶绿素含量均会发生一定的变化，同时，本研究的两年试验均是在充足的水肥条件下进行，所建模型可能仅限于在非生物逆境胁迫下进行叶绿素含量的监测，因此，该模型具有一定的局限性。后续研究中可设置胁迫环境，进一步延伸本研究内容。

4 结论

本研究结果表明，Fv/Fo、φPO、ψEO、φEO、ETO/CSM、PIABS、VJ7个荧光参数与叶绿素含量相关性较好。多元逐步回归模型y=-0.138x1+2.154x2+0.002x3+0.077x4+0.076(R2=0.694)(x1为Fv/Fo；x2为φPO；x3为ETO/CSM；x4为PIABS；y为叶绿素含量)优于其他模型。该模型弥补了非生物逆境胁迫下，大豆叶绿素荧光监测的空白，可以作为叶绿素含量估算的一种有效方法。ETO/CSM对叶绿素含量直接作用最大，φPO次之，Fv/Fo对叶绿素含量起直接负作用，PIABS直接作用最小。