2,4-表油菜素内酯结合氯化钙处理对采后杏果实黑斑病及苯丙烷代谢的影响

2022-10-30张亚琳马海娟任新雅张哲诚

核农学报 2022年12期

张昱石玲张亚琳马海娟任新雅张哲诚朱璇

(新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830000)

杏(PrunusarmeniacaL.)属蔷薇科(Rosaceae)杏属(Armeniaca)，是新疆的一种特色水果，其品种繁多，酸甜可口，风味独特，深受人们喜爱[1]。杏属于呼吸跃变型果实，其采收季节相对集中，采后生理代谢旺盛，易在贮藏运输中被微生物侵染，引起腐烂，从而造成严重的经济损失。由链格孢(Alternariaalternata)侵染引起的黑斑病是杏果实主要的采后病害之一[2]。目前，主要通过化学杀菌剂来控制杏果实采后病害，但由于其存在药剂残留、易产生抗药菌株及污染环境等问题而逐渐受到限制，因此迫切需要寻求一种安全有效的病害控制手段。

诱导抗性是一种利用安全性较高的外源刺激因子来诱导果蔬提升抗病性的新策略。果蔬在受到诱导因子刺激后，其自身会产生一系列的信号传导对刺激进行应答[3-5]。在信号传导过程中，信号分子不仅单独介导防御反应，还与其他信号传导途径相互作用。研究表明，植物激素和诸多第二信使在诱导抗性中起着重要作用[6]。油菜素内酯是公认的第六大类植物激素，是诱导植物在各个阶段抵抗逆境的一种甾醇类化合物[7-8]。2,4-表油菜素内酯(2,4-epibrassinolide, EBR)是一种人工合成且价格相对低廉的油菜素甾体化合物。在草莓[9]和葡萄[10]等果实中的研究表明，EBR可延缓果蔬衰老速度，延长贮藏时间。此外，EBR对桃[11]的软腐病，枣[12]的青霉病也有明显的抑制效果。钙是植物体内信号传导的第二信使[13]，可加固果实细胞壁，维持细胞膜的完整性[14-15]。果实中钙含量与病原菌侵染引起的采后病害密切相关[16]。已有研究表明，钙处理可显著降低甜樱桃灰霉病[17]和桃果实褐腐病[18]的发病率。目前，有研究已证实了复合保鲜剂相较于单一保鲜剂效果更优[18-19]。因此本试验采用EBR结合钙处理杏果实，从苯丙烷代谢角度出发，研究其代谢途径关键限速酶活性与抗病相关物质含量的变化，探究EBR与钙结合是否可协同增效，增强杏果实对黑斑病的抗性，旨在为杏果实贮藏保鲜提供理论依据与技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料赛买提杏果实于 2021年 6月 18日采自新疆英吉沙县乌恰镇19村试验田，剔除带有机械损伤和病虫害的杏果实，选取成熟度(可溶性固形物14.0%±0.5%、硬度25.0±0.5 N)、大小相近的杏果实，24 h内运回，于通风阴凉处除去田间热。

供试菌株：交孢链格孢(Alternariaalternata)，由新疆农业大学微生物实验室提供。

1.2 仪器与试剂

UF-103型紫外分光光度计，上海优尼克仪器有限公司；3HBRI型高速冷冻离心机，湖南海澜仪器设备有限公司；DYS-475型电导率仪，上海永仪电科学仪器有限公司；DCGS-6电热恒温水浴锅，北京永民医疗仪器厂；JA1003B型万分天平，三克(重庆)仪器有限公司。

β-巯基乙醇、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextroseagar, PDA)、马铃薯葡萄糖水培养基(potato dextrose broth, PDB)、昆布多糖、苯甲基磺酰氟、反式肉桂酸、p-香豆酸、辅酶 A、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)，北京索莱宝科技有限公司；L-苯丙氨酸、亮抑酶肽，天津致远化学试剂有限公司。试剂均为分析纯。

1.3 A. alternata离体抑菌试验

1.3.1A.alternata孢子悬浮液的配置参考Bi等[20]的方法。在无菌操作条件下，用无菌药匙刮下在PDA培养基中培养7 d的A.alternata孢子于锥形瓶中，加入适量的含有 0.05% Tween-80的无菌水，摇匀后用脱脂棉滤去絮状物，并将孢子悬浮液浓度调节到1×106个·mL-1。

1.3.2A.alternata菌落直径和孢子萌发率的测定参照Yao等[21]的方法并略作改进，将PDA培养基灭菌后，晾至45～50℃，分别加入3.0 mg·L-1EBR、2% CaCl2和3.0 mg·L-1EBR复合2% CaCl2溶液，以无菌水为对照。将6 mm交孢链格孢菌饼接种在凝固后的培养基中心，于28℃培养7 d后，用十字交叉法测量菌落直径，每个处理组重复3次。

参照王迪等[22]的方法并略作改进，将配置好的孢子悬浮液(1×106个·mL-1)置于PDB培养基中，分别加入3.0 mg·L-1EBR、2% CaCl2及3.0 mg·L-1EBR结合2% CaCl2溶液，以无菌水作为对照，于28℃培养，连续数小时镜检，直至对照组完全萌发，每次镜检100个孢子，每个处理组重复3次。按公式(1)计算孢子萌发率。

孢子萌发率=(萌发个数/100)×100%

(1)

1.4 原料处理

参照前期研究基础[23]及预试验结果，选择3.0 mg·L-1EBR及2% CaCl2作为处理浓度，分别用3.0 mg·L-1EBR、2% CaCl2、3.0 mg·L-1EBR结合2% CaCl2对果实进行减压处理，以0.05 MPa保持2 min后于常压下浸泡5 min的杏果实作为处理组，以含0.1%无水乙醇的蒸馏水处理的杏果实作为对照组，各组处理均3次重复，每次重复处理3.0 kg果实。待果皮表面无水滴后贮藏于温度1.0±0.5℃、相对湿度90%～95%的冷库中，48 h后进行损伤接种。

参考 Deng等[24]的接种方式进行损伤接种。先后分别用医用酒精及无菌水擦拭果实表面，晾干后用无菌铁钉于果实纵向中心线穿刺1个直径 2.5 mm、深 4.0 mm的小孔，而后注入15 μL孢子悬浮液，损伤完成后套好保鲜袋，于上述条件下贮藏49 d。定期取样，并测定相关指标。

1.5 测定项目与方法

1.5.1 发病率与病斑直径的测定发病率的统计：定期测定并统计贮藏期间杏果实的发病孔数(病斑直径大于等于2.5 mm记为发病孔)。

发病率=(发病孔数/总孔数)×100%

(2)

病斑直径的测定：采用十字交叉法，定期测量杏果实病斑直径，每组各测量20个杏果实，平行3次，取平均值，单位mm。

1.5.2 总酚和类黄酮含量的测定参照曹建康等[25]的方法，以每克鲜重果蔬组织在280 nm波长处的吸光度值表示总酚含量，即OD280 nm·g-1；以每克鲜重果蔬组织在325 nm波长处的吸光度值表示类黄酮物质含量，即OD325 nm·g-1。

1.5.3 木质素含量的测定参照刘国强等[26]的方法并略作改动，以每克鲜重果蔬组织在280 nm波长处的吸光度值表示木质素含量。

1.5.4 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、4-香豆酸辅酶A 连接酶(4-coumaric acid coenzyme-A-ligase, 4CL)、肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate-4-hydroxylase, C4H)活性的测定 PAL活性测定参照曹建康等[25]的方法，OD值以每小时变化 0.01 为 1 个酶活力单位(U)，单位U·g-1。

C4H、4CL活性测定参照范存斐等[27]的方法，OD值以每小时变化 0.01 为 1 个酶活力单位(U)，单位U·g-1。

1.6 数据处理

使用Sigma Plot 14.0和GraphPad Prism 8.0.2软件作图，用SPSS 22.0软件对试验数据进行方差分析，采用Duncan’s进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 EBR结合钙处理对A. alternata孢子萌发率和菌丝生长的影响

由表1可知，与对照组相比，EBR处理、氯化钙处理、EBR结合钙处理对A.alternata的孢子萌发率与菌落直径的抑制效果均无显著差异，说明EBR结合钙处理对A.alternata没有直接抑制作用。

表1 EBR结合钙处理对A. alternata孢子萌发率和菌丝生长的影响

2.2 EBR结合钙处理对杏果实接种发病率和病斑直径的影响

由图1-A可知，对照组杏果实从贮藏第14天开始发病，较EBR结合钙处理组杏果实提前了14 d。在贮藏第21天时，对照组、氯化钙处理组和EBR处理组的杏果实均表现出不同程度的发病情况，而EBR结合钙处理组杏果实尚未发病。在贮藏第28天时，EBR结合钙处理组杏果实接种发病率为38.33%，分别较对照组、氯化钙处理组显著降低了45%、25%(P<0.05)。而与EBR处理组差异不显著。

注：不同小写字母表示同一贮藏时间不同处理间差异显著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level between different treatments for the same storage time图1 EBR结合钙处理对杏果实接种发病率(A)和病斑直径(B)的影响Fig.1 Effect of EBR combined with calcium treatment on the inoculation incidence rate (A) and lesion diameter (B) of apricot fruit

由图1-B可知，从贮藏第35天开始，EBR结合钙处理组杏果实病斑直径显著低于对照组、氯化钙处理组和EBR处理组；贮藏结束时，EBR结合钙处理组杏果实病斑直径较对照组、氯化钙处理组、EBR处理组显著降低23.75%、20.23%、11.75%(P<0.05)。说明EBR结合钙处理能够有效抑制杏病斑直径的扩大。

上述试验结果表明，与对照组相比，EBR处理组、氯化钙处理组和EBR结合钙处理组对杏果实采后接种发病率和病斑直径都有一定的抑制作用，以EBR结合钙处理对杏果实采后接种A.alternata的控制效果最显著，故将EBR结合钙处理作为最佳处理组用于后续的试验分析。

2.3 EBR 结合钙处理对杏果实总酚、类黄酮及木质素含量的影响

如图2-A所示，在整个贮藏过程中，EBR结合钙处理组杏果实总酚含量一直高于对照组。与对照组相比，贮藏第42天时EBR结合钙处理组杏果实总酚含量显著升高了7.49%。说明EBR结合钙处理可促进杏果实贮藏期间总酚的积累。

由图2-B可知，在贮藏7 d后，EBR结合钙处理组杏果实类黄酮含量开始快速积累，在贮藏第21天时达到1.37 OD325 nm·g-1，是同期对照组的1.12倍(P<0.05)。贮藏结束时，处理组杏果实仍保持着较高的类黄酮含量。说明EBR结合钙处理可有效促进杏果实贮藏期间类黄酮的积累。

由图2-C可知，杏果实木质素含量随着贮藏时间的延长而增加，且EBR结合钙处理组杏果实木质素含量在整个贮藏期间内始终高于对照组。贮藏第14～第28天，木质素含量上升幅度增大。在贮藏第49 天时，EBR结合钙处理组木质素含量较对照组显著提高了11.86%(P<0.05)。说明EBR结合钙处理可促进杏果实贮藏期间木质素的积累。

注：*表示处理组与对照组之间差异显著(P<0.05)。下同。Note: * indicate significant difference between treatment group and control group(P<0.05). The same as following.图2 EBR 结合钙处理对杏果实总酚(A)、类黄酮(B)及木质素(C)含量的影响Fig.2 Effect of EBR combined with calcium treatment on total phenol (A), flavonoid (B) and lignin (C) content of apricot fruitc

2.4 EBR 结合钙处理对杏果实 PAL、C4H及4CL活性的影响

由图3-A可知，在贮藏第35天时，EBR结合钙处理组杏果实PAL活性达到峰值，为 31.50 U·g-1，相比于同期对照组显著提高了31.25%(P<0.05)。贮藏过程中对照组杏果实 PAL 活性峰值为 25.00 U·g-1，较处理组 PAL 活性峰值降低了20.63%。说明 EBR结合钙处理可提高贮藏期间杏果实的PAL活性。

由图 3-B可知，在贮藏第28天时，两组间杏果实 4CL活性差异最大，EBR结合钙处理组和对照组杏果实的4CL活性分别为 36.96和 32.83 U·g-1，处理组较对照组显著提高12.60%(P<0.05)。贮藏后期，两组杏果实的4CL活性差异不显著。说明 EBR结合钙处理可提高杏果实贮藏前期的4CL活性。

由图 3-C可知，贮藏第14天，EBR结合钙处理组杏果实C4H活性为 395.56 U·g-1，比对照组显著提高了21.50%(P<0.05)。在贮藏第42天时，处理组与对照组杏果实C4H活性分别为 455.56和399.44 U·g-1，处理组是对照组的1.14倍(P<0.05)。说明 EBR结合钙处理可增强贮藏期间杏果实的C4H活性。

图3 EBR 结合钙处理对杏果实 PAL(A)、4CL(B)及C4H(C)活性的影响Fig.3 Effect of EBR combined with calcium treatment on PAL(A)、4CL(B) and C4H(C) activity of apricot fruit

3 讨论

在离体试验中，各处理组A.alternata链格孢的菌落直径和孢子萌发率与对照组相比无显著差异，说明EBR与CaCl2对A.alternata没有直接抑制作用。此结果与黄雪梅等[28]和石玲等[29]的研究结果相似，EBR与钙均可通过激活果实抗病相关酶活性，诱导增强果实对病原菌的抗性。

苯丙烷代谢作为植物抵御病原菌侵害的关键次生代谢之一，在代谢过程中产生的次级代谢产物对病原菌具有抵御作用[30-31]。PAL作为苯丙烷代谢的关键酶，可将苯丙烷代谢的前体物质L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸[32]，随后反式肉桂酸被C4H水解，生成阿魏酸、香豆酸等酚酸。这些酚酸既可直接杀灭病原物，也可被4CL继续催化，生成酚类、类黄酮等的前体物质，继而进一步得到酚类、类黄酮等[31,33]。总酚、类黄酮作为苯丙烷代谢的次级代谢产物，一方面可有效抑制病原菌的生长，防止病原菌向周围组织扩散[34]；另一方面酚类物质是木质素合成的前体物质，当酚类物质大量积累时会促使木质素含量增加[32,35]。木质素作为一种重要的抗菌物质，既可切断果实体内养分向病原菌运送，又可增强被病原菌侵染周围细胞壁的坚固性，降低病原物在寄主组织中的扩散速度，从而使果实有足够的时间产生和积累更多的植保素，达到抑制病原菌生长繁殖的目的[36-37]。李丽花等[23]研究表明，外源EBR处理可通过诱导杏果实苯丙烷代谢相关酶活性上升来促进贮藏期间总酚、类黄酮和木质素的积累，以此达到增强杏果实抗病性的目的。本试验中，EBR结合钙处理组与氯化钙处理组和EBR单独处理组相比，整体显著提高了杏果实贮藏期间的PAL、C4H、4CL活性，促进了贮藏期间总酚、木质素与类黄酮的积累，并抑制杏果实接种发病率的上升与病斑直径的扩大。这可能是由于EBR与钙可作为信号分子激活苯丙烷代谢，并诱导增强PAL、C4H和4CL酶的活性，从而加快其代谢产物的合成与积累。此外，复配中钙的施用可维持并稳定细胞膜和细胞壁的结构与功能，这对抑制病原菌进一步的侵染也有重要意义[15,37]。与单一处理相比，复合处理起到协同增效作用，因此对黑斑病的抑制效果更显著。张志刚等[38]研究也表明，油菜素内酯与氯化钙复配可有效提高黄瓜幼苗对灰霉病的抗性，且效果优于单独处理。